Francisco Monci, Sonia Sanchez-Campos, Jesus Navas-Castillo, and Enrique Moriones

1. A Natural Recombinant between the Geminiviruses Tomato yellow leaf curl Sardinia virus andTomato yellow leaf curl virus Exhibits a Novel Pathogenic Phenotype and Is BecomingPrevalent in Spanish Populations Francisco Monci, Sonia Sanchez-Campos, Jesus Navas-Castillo, and Enrique Moriones Estacion Experimental “La Mayora”, Consejo Superior de Investigaciones Cientıficas, 29750 Algarrobo-Costa, Maaga, Spain Virology ; Received March 28, 2002; accepted June 25, 2002

2. Geminivirus • Virus émergents de plantes dicotylédones • Transmis par les insectes • Gimiviniridae • Mastrevirus • Curtovirus • Begomovirus • Capside jumelée icosaédrique • Génome • ADN circulaire simple brin • Monopartite ou dipartite

3. Begomovirus : TYLCSV & TYLCV • Structure du génome : • ADN monopartite • 2,8 kb • 6 ORF • Région interingénique • 300 nt • Boucle : stem-loop • Séquence de neuf nucléotides 5’-TAATATTAC-3’ : origine de réplication  Rep • Réplication : modèle du cercle roulant • Variations du génome : • Mutation • Réassortiment • Recombinaison

4. Begomovirus : TYLCSV & TYLCV • Transmission : Bemisia tabaci • Insecte nuisible = mouche blanche • Hémiptère, Aleyrodidae • Acquisition des virus lors repas • Présence dans les glandes salivaires • Pathologies • TYLCD  TYLCSV et TYLCV • BLCD  TYLCV • Malformations foliaires • Feuilles enroulées • Jaunissement

5. Epidémies de TYLCD en Espagne • Epidémie sur cultures de tomates • 1992  TYLCSV-ES • 1997  TYLCV-Mld associé à TYLCSV • 1999  ES421/99 : recombinant Monci et Al. 2001 • Caractérisation de ES421/99 • Détermination du génome • Transmission par B. tabaci • Pathogénicité : • Hôtes infectés • Expansion • L’apparition de nouvelles caractéristiques permettent-elles : • un avantage sélectif ? • d’augmenter la fréquence du virus dans la population ?

6. Isolat ES421/99 est un recombinant entre TYLCD & TYLCSV • Prélèvement de plants de haricots présentant un syndrome BLCD • Extraction du génome viral • Digestion par BamH1 • Southern Blot avec sondes spécifiques de TYLCSV  ADN 2,8 kb • Clonage dans un site BamHI de pBluescript • Séquençage avec primers internes et universels pUC/M13

7. Isolat ES421/99 est un recombinant entre TYLCD & TYLCSV • Comparaison de séquence ES421/99 : Wisconsin GCG • TYLCSV • TYLCV Organisation du génome similaire aux Begomovirus • ES421/99 résulte de la recombinaison entre génomes de TYLCSV & TYLCV • IR • 3’ de Ren ORF Conservation de Rep et motifs de IR : le virus peut se multiplier

8. Isolat ES421/99 est un recombinant entre TYLCD & TYLCSV

9. Infection à ES421/99 • Agroinoculation : • Transformation d’Agrobacter tumefaciens LBA 404 avec p1.4ES421/99 • Agroninoculation à 4 plants de haricots • Observation des symptômes Infection de 4/4 plants de haricots : le virus recombinant est infectieux

10. ES421/99 a un plus grand nombre d’hôtes • Agroinoculation de ES421/99, TYLCSV et TYLCV à un panel de plantes • 2 expériences répétées de 5 plantes / virus • Analyse après 30j : • Symptômes • Pétioles : • Hybridation • PCR • ES421/99 induit : • Une infection systémique • Des symptômes plus légers

11. Transmission du recombinant par B. tabaci Transmission par B. tabaci différente entre TYLCV et TYLCSV • Agroinoculation des virus à des plants de tomate ou de haricot  3S • Exposition à B. tabaci adultes biotype Q pendant 24h : AAP • Exposition des jeunes plants trifoliés sains de tomate pendant 48h à B. tabaci vecteurs : IAP • Chambre de culture • Analyse à J30 des pétioles par hybridation/tissue-blot • Contrôle à partir de plants sains ES421/99 est aussi efficacement transmis par B. tabaci biotype Q

12. Expansion dans la nature • Etude de la fréquence d’apparition de ES421/99-like dans des champs de tomate et de haricots dans le sud-est de l’Espagne • Malaga • Murcia • Almeria • Granada • Hybridation/PCR

13. Expansion dans la nature • Almeria : augmentation de la prévalence du recombinant : • Aucun recombinant en 1998 • 96,5% des échantillons infectés en 1999 • Malaga : • Pas de variants ES421/99-like observé

14. Expansion dans la nature • Almeria: • Prédominance TYLCV • Nombre significatif d’échantillon collecté avec ES421/99 en 2000 • ES421/99 déjà présent dans 4 plants co-infectés TYLCSV et TYLCV en 1998 • Malaga, Granada et Murcia : • Rares cas de recombinants bien que présence TYLCSV et/ou TYLCV •  Nouveaux virus variants •  Mutations au niveau des amorces de PCR

15. Expansion dans la nature Faible fréquence ES421/99-like chez les plantes symptomatiques 8,3 % par rapport aux asymptomatiques 26,7% et au total 16,7% Sous estimation dans les études précédentes Apparition de nouveaux variants viraux

16. Discussion • Apparition rapide des recombinants dans les infections mixtes • Bien que les deux virus parents soient présents à Malaga, Grenade et Murcia  2 échantillons avec recombinaison à Malaga Des facteurs écologiques doivent contribuer : • Établissement de la recombinaison • Expansion • D’autres types de recombinaisons sont possibles • La population de Begomovirus est très dynamique

17. Discussion • ES421/99 est un recombinant de TYLCV et TYLCSV • Bien adapté a une transmission par B. tabaci • Plus grand nombre de sujets réceptifs : • Atteinte d’hôtes plus large que les parents • Expansion des cultures infectées dans l’Almeria • La caractérisation de ES421/99 montre un avantage sélectif de ce recombinant par rapport à ses deux progéniteurs • Conséquences épidémiologiques importantes

18. Discussion • ES421/99 induit des symptômes plus légers chez la tomate • Transmission par B. tabaci diminué chez les plantes sévèrement atteintes • Expansion facilitée : augmentation du réservoir du virus • Infections répétées des tomates Ty-1 plus efficace que pour TYLCSV et TYLCV • Avantages sélectifs  problèmes épidémiologiques importants pour les cultures