SH-SY5Y

1. A control RNA SH-SY5Y DU145 LNCaP LNCaP Acqua PC3 PC3 NPY 335 bp B Control RNA LNCaP SK-N-MC DU145 Acqua LNCaP PC3 PC3 MW Y1-R 354 bp ß-actina 660 bp Figura 1: Espressione di NPY e del recettore Y1 in cellule di PCa umano.A) Analisi RT-PCR dell’espressione genica dell’NPY nelle linee cellulari di PCa umano LNCaP, DU145 e PC3 e in quella di neuroblastoma umano SH-SY5Y (controllo positivo). Usando oligoprimers specifici per NPY, è stata valutata la presenza del prodotto di amplificazione di opportuna dimensione (335 bp). Come controllo interno (control RNA) è stato usato un RNA plasmidico delle dimensioni di 308 bp. B) Analisi RT-PCR dell’espressione genica del Y1 (356 bp) e della βactina (660 bp) nelle linee cellulari di PCa umano. La linea cellulare di neuroblastoma umano SK-N-MC è stata usata come controllo positivo (Larhammar, D. 1992).

2. b a 50 µm 50 µm A SK-N-MC LNCaP LNCaP DU145 PC3 PC3 kDa 160 105 75 50 B Figura 2: A) Analisi Western blot dell’espressione del recettore Y1 in linee cellulari di PCa umano. Gli estratti cellulari sono stati sottoposti ad analisi Western blot usando un antisiero contro il Y1 umano. B) Analisi immunoistochimica del Y1 in campioni post-operatori di PCa. Pannello a) e b): le frecce indicano la distribuzione dell’immunoreattività del Y1 a livello della membrana plasmatica. Le immagini si riferiscono a campi differenti della stessa sezione (ingrandimento 400X). Il campione mostrato è rappresentativo di una serie di sei. La scale bar mostrata in ognuno dei pannelli è di 50 µm.

3. LNCaP 20 Cellulle / piastra X 10-4 16 * * * * * * 12 8 4 0 40 DU145 Cellulle / piastra X 10-4 30 * * * * * * * * * * * * 20 10 0 * * * PC3 * * * 50 * * * Cellulle / piastra X 10-4 * * * * * * 40 30 20 10 0 _ NPY (M) 10-7 10-9 10-8 10-10 5x10-9 5x10-8 Figura 3: Effetto dell’NPY sulla proliferazione cellulare (linee cellulari di PCa). Le linee cellulari LNCaP, DU145 e PC3 sono state esposte per 96 ore a concentrazioni diverse di NPY; al termine dell’incubazione le cellule sono state raccolte e contate. I dati sono espressi come media ± SEM; n=5; * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 vs. controlli (-) (ANOVA).

4. LNCaP DU145 PC3 * * 10 0.8 1.8 1.5 8 0.6 * * 1.2 6 Cellule / piastra X 10-5 0.4 9 * * 4 6 0.2 2 3 0 0 0 - + - + - + - + - + - + NPY - - + + - - + + - - + + BIBP3226 Figura 4: Coinvolgimento del recettore Y1 nella proliferazione NPY-mediata nelle linee cellulari di PCa. Le linee cellulari LNCaP, DU145 e PC3 sono state trattate per 96 ore sia con NPY 10 nM e BIBP3226 1 µM da soli, che con entrambi. Alla fine dell’incubazione, le cellule sono state raccolte e contate. I dati sono espressi come media ± SEM; n=5; ** p<0.001 vs. controlli (-) (ANOVA). A LNCaP DU145 PC3 pERK1/2 ERK1/2 0 0 1 5 15 30 60 0 5 15 60 120 240 360 0 0 1 5 15 30 60 Tempo di incubazione (min) NPY 10-8 M NPY 10-8 M NPY 10-8 M 120 700 * 400 * B * 600 100 * * * * 300 500 * * 80 400 * * pERK1/2/ ERK1/2 (% del controllo) 60 200 300 40 200 100 20 100 0 0 0 Tempo di incubazione (min) 1 5 15 30 60 1 5 15 30 60 15 30 60 120 240 360 Figura 5: Effetto del trattamento con NPY sulla fosforilazione di ERK1/2 nelle linee cellulari di PCa umano. A) Analisi Western blot dei livelli di pERK1/2 nelle cellule LNCaP e PC3 dopo trattamento (0-60 minuti) e nelle cellule DU145 (0-360 minuti) con NPY 10-8 M. In figura è mostrato un esperimento rappresentativo di tre. B) Analisi densitometrica relativa a tre esperimenti separati, uno dei quali mostrato nel pannello A). I livelli di ERK1/2 fosforilato sono stati normalizzati con i livelli di ERK1/2. I valori sono espressi come media ± SEM, n=3, * p<0.05, ** p<0,01 vs. controllo (0), (ANOVA).

5. kDa DU145 - 44 pERK1/2 - 42 - 44 ERK1/2 - 42 PC3 - 44 pERK1/2 - 42 - 44 ERK1/2 - 42 - - + + NPY - + - + GF109203X Figura 6: Effetto del pretrattamento con GF109203X sulla fosforilazione NPY-indotta di ERK1/2. Analisi Western blot dei livelli di pERK1/2 nelle cellule DU145 e PC3, dopo un pretrattamento (30 minuti) con GF109203X 10-7 M e susseguente esposizione (15 minuti) ad NPY 10-8 M DU145 PC3 kDa kDa A 75 75 50 50 pERK1/2 35 35 75 75 50 50 ERK1/2 35 35 B 1.00 1.2 1.0 0.75 0.8 pERK/ERK1/2 0.50 0.6 0.4 0.25 0.2 0 0 - - + + - NPY - + + BIBP3226 - - + + - - + + Figura 7: Effetto del pretrattamento con BIBP3226 sulla fosforilazione NPY-mediata di ERK1/2. A) Analisi Western blot dei livelli di pERK1/2 nelle cellule DU145 e PC3, dopo un pretrattamento (45 minuti) con BIBP3226 10-6 M e susseguente esposizione (15 minuti) ad NPY 10-8 M. B)Analisi densitometrica relativa al pannello A). I livelli di pERK1/2 sono stati normalizzati con i livelli di ERK1/2.

6. LNCaP 9 7 6 Incorporazione di [3H]-timidina (cpm/pozzetto * 10-4) * * 4.5 * * * * * * ° 3 * * 1.5 0 DU145 25 * * 20 * * * * * * * * 15 Incorporazione di [3H]-timidina (cpm/pozzettol * 10-4) 10 50 0 PC3 * 7.5 ° ° * * * * * * * * 5 Incorporazione di [3H]-thimidina (cpm/pozzetto * 10-4) 2.5 0 - - - + + + NPY - + - - + - U0126 - - + - - + GF109203X Figura 8: Coinvolgimento della via MAPK/ERK1/2 nella proliferazione cellulare NPY-mediata (test dell’incorporazione di [3H]timidina). Le cellule LNCaP, DU145 e PC3 sono state pretrattate (30 minuti) sia con U0126 10-6 M che con GF109203X 10-7 M e quindi esposte per 48 ore ad NPY 10-8 M. Alla fine dell’incubazione, in tutte le linee di PCa è stata valutata l’incorporazione di [3H]timidina. I dati sono espressi come media dei cpm/pozzetto*10-4± SEM, n=4, * p<0.05, ** p<0.001 vs. controlli (-), ° p<0.001 vs. NPY, (ANOVA).

7. LNCaP DU145 PC3 * * 4 * * * * 3 2 cAMP (pmol/pozzetto) ° 1 0 - + - + - + - + - + - + NPY - - + + - - + + - - + + Forskolina Figura 9: Effetto del trattamento con NPY sui livelli intracellulari di cAMP, in linee cellulari di PCa umano. Le cellule di PCa sono state trattate per 15 minuti sia con NPY 10 nM che con forskolina 5 µM e con la combinazione delle due sostanze. I dati sono espressi come media ±SEM, n=6. ** p< 0.001 vs. controlli; °p< 0.001 vs. forskolina.

8. 300 LNCaP A23187 10-6 M 260 220 180 [Ca++]i (nM) 140 NPY 10-8 M 100 60 20 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 550 DU145 ATP 10-4 M 500 450 400 350 300 [Ca++]i (nM) 250 200 NPY 10-8 M 150 100 50 0 0 200 400 600 800 1000 ATP 10-4 M 550 PC3 500 450 400 350 300 [Ca++]i (nM) 250 NPY 10-8 M 200 150 100 50 0 0 200 400 800 1000 600 Figura 10: Effetto del trattamento con NPY sui livelli di [Ca+2]i, in linee cellulari di PCa umano. Le cellule sono state trattate con NPY 10-8 M e susseguentemente con appropriate sostanze per testare la responsività delle cellule (ATP 10-4 M o A23187 10-6 M). Il [Ca+2]i è stato misurato utilizzando la sonda fluorescente fura-2. Nelle cellule LNCaP i livelli basali di [Ca+2]ierano di 49 nM con valori massimi di 230 nM dopo trattamento con A23187 10-6 M; nelle cellule DU145 i valori basali di [Ca+2]i erano di 32 nM con valori massimi di 480 nM dopo trattamento con ATP 10-4 M; nelle cellule PC3 i valori basali di [Ca+2]i erano 86 nM con valori massimi di 510 nM dopo trattamento con ATP 10-4 M.

9. Acqua NFPA LNCaP MW Somatostatina 349 bp 318 bp sst1 414 bp sst2A sst3 95 bp sst4 321 bp sst5 226 bp 18S 250 bp Figura 11: Espressione di somatostatina e dei recettori ssts in cellule LNCaP (PCa umano androgeno-dipendente).Analisi RT-PCR dell’espressione genica della somatostatina e dei suoi cinque recettori nelle linea cellulare di PCa umano androgeno dipendente, LNCaP e in un campione post-operatorio di NFPA (Non functional pituitary adenoma; controllo positivo). Usando oligoprimers specifici per la somatostatina è stata valutata la presenza del prodotto di amplificazione di opportuna dimensione (349 bp), così come per sst1 (318 bp), sst2A (414 bp), sst3 (95 bp), sst5 (226 bp). Nessun prodotto è stato rilevato per sst4. Per il 18S (gene ad espressione costitutiva) è stato evidenziato un prodotto specifico di 250 bp.

10. Acqua MW NFPA LNCaP ZAC 308 bp Acqua LNCaP MW PSA 376 bp Acqua MW NFPA LNCaP 18S 250 bp A B Figura 12: Analisi RT-PCR dell’espressione genica dell’oncogene ZAC e del prostate specific antigen (PSA) nella linea cellulare di PCa umano LNCaP. A) Usando oligoprimers specifici per ZAC, è stata valutata la presenza di un prodotto di amplificazione di opportuna dimensione (308 bp) così come per il 18S (gene ad espressione costitutiva; 250 bp). Un campione di NFPA è stato utilizzato come controllo positivo. B) Analisi RT-PCR dell’espressione genicadel PSA nella linea cellulare di PCa umano LNCaP. Usando oligoprimers specifici per il PSA è stata valutata la presenza di un prodotto di amplificazione di opportuna dimensione (376 bp).

11. +Ab -Ab Figura 13: Analisi Immunocitochimica dell’espressione di ZAC in cellule LNCaP (PCa umano androgeno dipendente). L’intensa colorazione bruno-giallastra (“+Ab”) indica la distribuzione dell’immunoreattività a livello del nucleo della cellula in seguito ad incubazione con anticorpo specifico per la proteina hZAC. Il pannello “-Ab” rappresenta un’immagine della linea cellulare controllo. Le foto sono state ottenute con un microscopio a fase diretta (ingrandimento 100 X).

12. kDa kDa 83 83 62 62 47.5 47.5 32.5 32.5 25 25 Peptide controllo Calu-6 LNCaP Calu-6 LNCaP sst2A sst1 Figura 14: Analisi Western blot deil’espressione dei recettori sst1 e sst2A nella linea cellulare di PCa umano androgeno dipendente, LNCaP. Gli estratti cellulari sono stati sottoposti ad analisi Western blot usando anticorpi specifici anti sst1 e sst2A. Bande specifiche sono state evidenziate sia per sst1 che sst2A all’altezza di 60 kDa. La linea cellulare Calu-6 è stata utilizzata come controllo positivo. Nel pannello del recettore sst1 è presente anche il peptide controllo dell’anticorpo.

13. kDa kDa 83 83 62 62 47.5 47.5 32.5 32.5 25 25 Calu-6 LNCaP Calu-6 LNCaP sst5 sst3 Figura 15: Analisi Western blot dei recettori sst3 e sst5 nella linea cellulare di PCa umano androgeno dipendente, LNCaP. Gli estratti cellulari sono stati sottoposti ad analisi Western blot usando anticorpi specifici anti sst3 e sst5. Bande specifiche sono state evidenziate all’altezza di 45 kDa per sst3 e di 80 kDa per sst5. La linea cellulare Calu-6 è stata utilizzata come controllo positivo.

14. 12 * * * * * * * * 8 Cellulle / piastra X 10-4 4 0 SS14 - 10-10 10-9 10-8 10-7 A 15 * * * * 10 * * * * * * Incorporazione di [3H]-thimidina (cpm/pozzetto * 10-4) 5 0 SS14 - 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 B Figura 16: Effetto antiproliferativo della SS14 sulla proliferazione cellulare della linea di PCa androgeno dipendente, LNCaP. A) Incorporazione di [3H]-timidina.Le cellule LNCaP sono state esposte per 24 ore a diverse concentrazioni di SS14. Alla fine dell’incubazione è stata valutata l’incorporazione di [3H]-timidina SS14-indotta. I dati sono espressi come media dei cpm/pozzetto*10-4± SEM, n=4, * p<0.05, *** p<0.001 vs. controlli (-) (ANOVA). B) Conta cellulare.Effetto di SS14 sulla proliferazione cellulare della linea cellulare di PCa androgeno dipendente, LNCaP. Le cellule sono esposte per 96 ore a concentrazioni diverse di SS14; al termine dell’incubazione le cellule sono state raccolte e contate. I dati sono espressi come media ± SEM; n=5; * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 vs. controlli (-) (ANOVA).

15. Composto A - 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 A Lanreotide 70 * 50 * * * * * Incorporazione di [3H]-thimidina (cpm/pozzetto * 10-4) 30 10 0 Lanreotide - 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 B Composto A 75 * 50 * * * Incorporazione di [3H]-thimidina (cpm/pozzetto * 10-4) * * * * * * * * 25 0 Figura 17: Effetto antiproliferativo del lanreotide sulla proliferazione cellulare della linea di PCa androgeno dipendente, LNCaP. A) Incorporazione di [3H]-timidina. Le cellule LNCaP sono state esposte per 24 ore a diverse concentrazioni di lanreotide. Alla fine dell’incubazione, è stata valutata l’incorporazione di [3H]-timidina lanreotide-indotta. I dati sono espressi come media dei cpm/pozzetto*10-4± SEM, n=4, * p<0.05, ***p<0.001 vs. controlli (-) (ANOVA). B) Incorporazione di [3H]-timidina.Effetto antiproliferativo del composto A sulla proliferazione cellulare della linea di PCa androgeno dipendente, LNCaP. Le cellule LNCaP sono state esposte per 24 ore a diverse concentrazioni del composto B. Alla fine dell’incubazione, è stata valutata l’incorporazione di [3H]-timidina composto A-indotta. I dati sono espressi come media dei cpm/pozzetto*10-4± SEM, n=4, * p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001 vs. controlli (-) (ANOVA).

16. Composto B 25 20 15 Incorporazione di [3H]-thimidina (cpm/pozzetto * 10-4) * * * * * * 10 * * * * * * * * * 5 0 Composto B - 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 Figura 18: Effetto antiproliferativo del composto B sulla proliferazione cellulare della linea di PCa androgeno dipendente, LNCaP. Incorporazione di [3H]-timidina.Le cellule LNCaP sono state esposte per 24 ore a diverse concentrazioni del composto B. Alla fine dell’incubazione, è stata valutata l’incorporazione di [3H]-timidina composto B-indotta. I dati sono espressi come media dei cpm/pozzetto*10-4 ± SEM, n=4, ***p<0.001 vs. controlli (-) (ANOVA).