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生体試料を用いた

2012 ． 03.17 　最終ミーティング（神戸）　. 生体試料を用いた. 環境中有害化学物質暴露の健康影響評価. 兵庫県環境研究センターの役割. ・分析方法の開発. ・生体試料の採取と健康状況調査. ・生体試料中有害化学物質濃度の測定. （ POPs ， PCB, Pesticides, PFCs, PAHs ）. ・プロファイリングと健康影響評価. 松村千里、鶴川正寛、羽賀雄紀、鈴木元治、竹峰秀祐、奥野俊博、中野武. 報告内容. 1． RP- カラム（試作品）による抱合体の保持. ・グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体の保持

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生体試料を用いた

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Presentation Transcript

  1. 2012．03.17　最終ミーティング（神戸）　 生体試料を用いた 環境中有害化学物質暴露の健康影響評価 兵庫県環境研究センターの役割 ・分析方法の開発 ・生体試料の採取と健康状況調査 ・生体試料中有害化学物質濃度の測定 （POPs，PCB, Pesticides, PFCs, PAHs） ・プロファイリングと健康影響評価 松村千里、鶴川正寛、羽賀雄紀、鈴木元治、竹峰秀祐、奥野俊博、中野武

  2. 報告内容 1．RP-カラム（試作品）による抱合体の保持 ・グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体の保持 ・充填量を240mgに増加したRP-SAX、RP-WAXの使用 2．尿中のPFCs濃度 ・分析方法の検討及び測定結果 3．尿中のPOPs、PCB濃度 ・分析方法の検討及び測定結果 4．尿中のOH-PCBs濃度 ・分析方法の検討及び測定結果 ・PCB取扱者の尿中濃度測定結果

  3. 1．RP-カラムによる抱合体の保持 4-Nitrophenyl beta-D-Glucuronide(p-NPG)を用いてRP-SAX、RP-WAXによるグルクロン酸抱合体の保持、尿色素との分離を検討 p-NPGの構造式 β-Glucuronidase p-NPG + H2O Glucuronic acid + p-NP

  4. 1．ByRP-columnによる抱合体の保持 Separation of p-NPG and urine 色素　by RP-SAX（240mg） p-NP Sample: Water 100mL, Urine 35mL Sample +p-NPG RP-SAX 1 Ethyl acetate 6mL 2% HCOOH/MeOH 4mL 2 3 5% HCOOH/MeOH 4mL urine 4 10% HCOOH/MeOH 4mL + 0.02M phosphoric buffer（pH7） + β-Glucuronidase(140U/mL) Incubation 37 deg, 1hr OD measurement λ=405mm

  5. 1．RP-カラムによる抱合体の保持 Separation of p-NPG and urine 色素　by RP-WAX（240mg） Sample: 1%NaClaq 50mL, Urine 260mL(Aろ紙で濾過、2分割） Sample +p-NPG p-NP RP-WAX wash Water 5mL MeOH 5mL 1 0.001% NH4OH/MeOH 5mL 2 3 0.002% NH4OH/MeOH 5mL 3 0.005% NH4OH/MeOH 5mL 尿色素 3 0.01% NH4OH/MeOH 5mL 3 0.05% NH4OH/MeOH 5mL 3 0.1% NH4OH/MeOH 5mL Incubation λ=405mm OD measurement

  6. 1．RP-カラムによる抱合体の保持 Phenolphthalein（PP）のグルクロン酸抱合体、硫酸抱合体を用いてRP-SAX、RP-WAXによる保持、尿色素との分離を検討 P-NPと構造の異なるPPを用いることで、新しいカラムの吸着性能を確認 PPの構造式（pH<8.3） PPのグルクロン酸抱合体 Phenolphthalein-β-D-Glucuronide･Na salt (PPGNa) PPの硫酸酸抱合体 Phenolphthalein-Disalfuric acid･3K salt hydrate (PPSAK) 分解酵素 β-Glucuronidase/arylsulfatase (GN-ASEz)

  7. 1．RP-カラムによる抱合体の保持 グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体の保持、溶出パターン Sample Sample RP-SAX RP-WAX Ethyl acetate 6mL 1 0.01% NH4/MeOH 2mL 1 5% HCOOH/MeOH 4mL 2 0.1% NH4/MeOH 5mL 2 3 10% HCOOH/MeOH 4mL p-NP、PPのグルクロン酸抱合体はRP-WAX,RP-SAXともに同様の挙動。 PPの硫酸抱合体はRP-WAXでグルクロン酸抱合体と似た挙動。 しかし、RP-SAXでの保持、溶出方法は不明。 50%でも不検出

  8. 1．RP-カラムによる抱合体の保持 まとめ

  9. 2．尿中のPFCs濃度 分析方法の検討及び測定結果

  10. 2．尿中のPFCs濃度 2.1　分析手順 遠沈 or ろ過後2倍希釈し、 2つに分割してそれぞれカラムに通水 Sample add surrogate RP-WAX MeOH 3mL fraction 1 0.01% NH4/MeOH 5mL fraction 2 0.1% NH4/MeOH 5mL fraction 3 Each fraction concentrated to near dry add 0.02M phosphoric buffer（pH7）　3mL add GN-ASEz (2.2mM)10uL Incubation 37 deg, 1hr add 0.1M TBA 5mL add 0.25M carbonic buffer 10mL add MTBE 15mL Extraction with MTBE Concentration dehydration, chang the solvent to MeOH add SYS LC/MS ※RP-WAX通過水はPR-SAXを用いて処理

  11. MeOH 3mL fraction 1 0.01% NH4/MeOH 5mL fraction 2 0.1% NH4/MeOH 5mL fraction 3 2．尿中のPFCs濃度 2.2　サロゲート回収率 Urine (Mr.S) Urine (Mr.N) Urine (Mr.N) 酵素処理なし Water

  12. 2．尿中のPFCs濃度 2.3　分析結果 Urine (Mr.S) Urine (Mr.N) 昨年度と同様にPFCAsでは低炭素鎖のものが主に検出。PFASsはほとんど検出されず。 （注）濃度レベルは<1～100 pg/mLであり、昨年度（<1～30 pg/mL）よりやや高めであるが、回収率が悪く、検出強度が小さいことから参考値とする。

  13. 3．尿中のPOPs、PCBs濃度 分析方法の検討及び測定結果

  14. 3．尿中のPOPs、PCBs濃度 3.1　分析手順 ろ過（5A）後2 倍希釈 Sample add surrogate PS-2 RP-WAX＋PS-2 （or RP-SAX） DCM 30mL 0.1% NH4/MeOH 6mL concentrated to near dry add 0.02M phosphoric buffer（pH7） Sample1のみ add GN-ASEz (2.2mM)10uL Incubation 37 deg, 1hr chang the solvent to Hx Extraction with Hx Clean up LC-Si Concentration 100uL add SYS HRGC/HRMS

  15. 3．尿中のPOPs、PCBs濃度 3.2POPsサロゲート 　　　回収率 ※後段のPS-2（RP-SAX）からは不検出。

  16. 3．尿中のPOPs、PCBs濃度 3.3POPs分析結果

  17. 3．尿中のPOPs、PCBs濃度 3.4PCBsサロゲート回収率 回収率は、1～4塩素体で40～70%程度であり。5塩素体以上では10～30%程度であった。後段のPS-2、SAXからはPCBは不検出であったことから、WAXからの破過はなかったと考えられる。

  18. 3．尿中のPOPs、PCBs濃度 3.5PCBs分析結果 PCBsはほとんどがトレースレベルであった。3塩素体、4塩素体は他よりもピークが見えたが、コンタミの可能性がある。ブランクを取る必要がある。

  19. 4．尿中のOH-PCBs濃度 分析方法の検討及び測定結果

  20. 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.1　酵素処理によるロス（分解、揮発など）のチェック

  21. 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.2RP-WAX、RP-SAXの回収率 尿試料5mLにOH-PCB標品混合液及びサロゲートを添加し、RPカラムに通水。 充填量120mg RP-WAX RP-SAX

  22. 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.3　分析手順 Sample 200mL filtration 5A filter ×1/2 by Water dilution RP-WAX ×4本 充てん量は240mg 尿200ml通液するのに４本を要した MeOH 6mL 1 Pass water 4 0.01% NH4/MeOH 6mL 2 0.1% NH4/MeOH 6mL 3 1-3 fraction add surrogate 20uL concentration add 0.02M phosphate buffer（pH7）3mL add GN-ASEz 20uL Incubation 37 deg, 90min Extraction with Hx shaking dehydration, concentration OH-PCB pretreatment

  23. 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.4　尿中OH-PCBsのマスクロマトグラム OH-TrCBs OH-TeCBs OH-PeCBs OH-HxCBs

  24. 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.4OH-PCBs分析結果 （ng/L） 尿からはOH-PCBsが6.2 ng/Lで検出され、 5塩素体、6塩素体が主であった。

  25. 2～4．尿中のPFCs、POPs、PCBs及びOH-PCBsの測定 まとめ

  26. 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.5PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化

  27. 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.5PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化

  28. 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.5PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化

  29. 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.5PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化

  30. 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.5PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化 PCB作業従事者 （No.44） 60代 一般成人男性 20代 一般成人男性 　尿中OH-PCBsのマスクロマトグラム(OH-TrCBs)

  31. 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.5PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化 PCB作業従事者 （No.44） 60代 一般成人男性 20代 一般成人男性 　尿中OH-PCBsのマスクロマトグラム(OH-TeCBs)

  32. 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.5PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化 PCB作業従事者 （No.44） 60代 一般成人男性 20代 一般成人男性 　尿中OH-PCBsのマスクロマトグラム(OH-PeCBs)

  33. 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.5PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化 PCB作業従事者 （No.44） 60代 一般成人男性 20代 一般成人男性 　尿中OH-PCBsのマスクロマトグラム(OH-HxCBs)

  34. 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.5PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化

  35. 4.5PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化 まとめ

  36. 5．今後の検討課題

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