MESSAGGI DELL’INGEGNERIA DEI TESSUTI: I SOSTITUTI CUTANEI

1. SIFIPAC PADOVA 2009 MESSAGGI DELL’INGEGNERIA DEI TESSUTI: I SOSTITUTI CUTANEI Giovanni Abatangelo Unità di Ricerca sulla Ingegneria dei Tessuti Dipartimento di Istologia, Microbiologia e Biotecnologie Mediche Università di Padova

2. RICOSTRUZIONE DI TESSUTO/ORGANO In vitro In vivo Ingegneria dei tessuti Induzione rigenerativa

3. INGEGNERIA DEI TESSUTI L’ingegneria dei tessuti nasce come tentativo di costruire tessuti ed organi al di fuori del corpo umano PRESUPPOSTO La quasi totalità delle cellule animali possono essere coltivate in laboratorio

4. Componente biologica Cellule e/o fattori molecolari Supporto tridimensionale Biomateriale Ingegneria Tessutale Elementi base

5. Ingegneria Tessutale Componente biologica Cellule: • differenziate • indifferenziate

6. La cute CON L’INGEGNERIA TISSUTALE E’ OGGI POSSIBILE OTTENERE, A PARTIRE DA UNA PICCOLA BIOPSIA, TESSUTI DA TRAPIANTARE SU LESIONI CUTANEE

7. PELLE ARTIFICIALE Di solito, una ferita cutanea guarisce spontaneamente. In alcuni casi, però non si può attendere o non è facile ottenere il ripristino spontaneo: • vaste ustioni ( se non si interviene c’è rischio di morte) • ulcere croniche (dismetaboliche, vascolari, diabetiche ecc.) • ulcere da decubito o da compressione • vaste e profonde ferite chirurgiche

8. PELLE ARTIFICIALE L’auto-trapianto di lembi di cute rappresenta la soluzione migliore per la copertura di ferite difficili. quando ciò non è possibile (vaste ustioni, ferite croniche, ecc.), bisogna ricorrere alla pelle artificiale da una piccola biopsia di cute del paziente (2x2 cm) si può ottenere fino ad 1 mq di epidermide e di derma.

9. DERMA ARTIFICIALE Grazie alla tecnologia dei polimeri oggi disponiamo di biomateriali tridimensionali all’interno dei quali abbiamo coltivato cellule dello stesso paziente (fibroblasti) che producono un tessuto simile al derma. con questa tecnica siamo in grado di trattare numerose lesioni cutanee che vanno dalle vaste ustioni alle ulcere croniche e a quelle chirurgiche

10. Cellule Staminali dell’epidermide • L’epidermide è un epitelio dinamico che si rinnova continuamente per tutta la vita • Il suo turnover è di circa 7 giorni nell’uomo. • Questo rapido turnover nell’adulto richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a cellule mature

11. Cellule Staminali dell’Epidermide • Tre categorie di cheratinociti con capacità proliferativa: • OLOCLONI • MEROCLONI • PARACLONI

12. Cellule Staminali dell’epidermide IL PASSAGGIO DA HOLO- A MERO- E A PARACLONE E’ IRREVERSIBILE Solo gli olocloni sono vere stem cell, in virtù della loro capacità di auto rinnovamento

13. Esterno Cellule Staminali dell’epidermide Lo strato basale, contiene le cellule proliferanti che migrano verso gli strati superiori dove vanno incontro a differenziamento che porta alla formazione di cellule terminali prive di nucleo. Basale Epidermide

14. Cellule Staminali dell’epidermide

15. Cellule Staminali dell’epidermide Sono presenti anche tra i cheratinociti dellla guaina del bulbo pilifero

16. Come si isolano le cellule staminali dell’ epidermide

17. Cellule Staminali dell’epidermide • I marcatori sono: • ß1 integrine • p63 • keratins 19 and 15 • non-cadherin-associated ß-catenin

18. Ricostruzione in vitro di un equivalente epidermale • Tecnica di Rheinwald & Green • dopo 14 – 21 giorni • 2cm2 2m2

19. Recenti conquiste dell’ingegneria tessutale … siamo all’inizio della fine o alla fine dell’inizio ….

20. Recenti conquiste dell’ingegneria tessutale • EVOLUZIONE DELLE METODICHE DI COLTURA CELLULARE IN VITRO • EVOLUZIONE DEI BIOMATERIALI

21. PROTESI VASCOLARI NICOLAS L’HEUREUX et al. Human tissue-engineered blood vessels (28 wk) for adult arterial revascularization. Nat Med. 2006 Mar;12(3):361-5. TESSUTO ADIPOSO SOSTITUTI CUTANEI AOKI S et al. Coculture of endothelial cells and mature adipocytes actively promotes immature preadipocyte development in vitro. Cell Struct Funct. 2003 Feb;28(1):55-60 ABATANGELO G et al. In vitro reconstruction of an endothelialized skin substitute provided with a microcapillary network using biopolymer scaffolds. FASEB J. 2005 Sep;19(11):1546-8. • EVOLUZIONE DELLE METODICHE DI COLTURA CELLULARE IN VITRO Colture in monostrato Colture su matrici tridimensionali Co-colture di differenti popolazioni cellulari su matrici tridimensionali

22. SOSTITUTI CUTANEI UN TIPO CELLULARE CHERATINOCITI FIBROBLASTI

23. LAMINE DI CHERATINOCITI • La sopravvivenza cellulare è direttamente correlata con • le condizioni del letto ricevente. • In particolare, la presenza di uno strato dermico ne • incrementa la sopravvivenza Fibroblasti ECM Micro-vascolarizzazione

24. a b 7 giorni di co-cultura 14 giorni di co-cultura 7 days 14 days Primo “step”: construtto cutaneo doppio strato Due tipi cellulari La co-cultura di fibroblasti e cheratoniciti ha dimostrato la possibilità di ottenere un construtto cutaneo doppio strato, epidermico e dermico.

25. COLTURA COMPOSITA DI 3 TIPI CELLULARI FIBROBLASTI CELLULE ENDOTELIALI CHERATINOCITI PELLE ENDOTELIALIZZATA

26. Progressiva formazione di strutture microcapillari ad anello Progressivo inspessimento dello strato epidermico (Ab anti-pancitokeratine)

27. Immunolocalizzazione del CD31 a livello delle strutture microcapillari ad anello.

28. Strutture microcapillari evidenziate dalle cellule endoteliali positive al vWF (21 giorni di coltura composita)

29. Immunolocalizzazione dello strato epidermico e delle strutture micro-capillari. Cellule positive Anti- keratine e vWF Co-localizzazzione del vWf e della laminina a livello dei capillari

30. Il trattamento delle perdite di sostanza cutanea di diversa eziologia con un sostituto cutaneo provvisto di una rete microcapillare dovrebbe favorire l’integrazione in vivo del sostituto ed incrementare la velocità e qualità della guarigione.

31. Ingeneria dei tessuti in vivo Sfrutta la possibilità di utilizzare biomateriali “biomimetici” in grado di orchestrare gli eventi rigenerativi direttamente in vivo, senza pre-trattamenti cellulari o farmacologici in vitro. Ha come obiettivo principale quello di sviluppare una protesi biocompatibile, con caratteristiche meccaniche idonee a mantenere le condizioni fisiologiche di flusso, fintantoché non sono terminati i processi di rimodellamento cellulare che porteranno alla rigenerazione di un nuovo tratto arterioso. La possibilità di avere un biomateriale in grado di essere rimodellato in vivo rappresenta l’evento fondamentale per ottenere una protesi vascolare ideale.

32. MEDICINA RIGENERATIVA Induzione in vivo di un nuovo organo o tessuto con le stesse proprietà fisiologiche dell’organo perduto. La medicina rigenerativa è il nuovo obiettivo della ingegneria dei tessuti Scaffold riassorbibile In grado di orchestrare in vivo gli eventi rigenerativi Che viene completamente riassorbito a rigenerazione avvenuta

33. Ingeneria dei tessuti in vivo Sfrutta la possibilità di utilizzare biomateriali “biomimetici” in grado di orchestrare gli eventi rigenerativi direttamente in vivo, senza pre-trattamenti cellulari o farmacologici in vitro. Ha come obiettivo principale quello di sviluppare una protesi biocompatibile, con caratteristiche meccaniche idonee a mantenere le condizioni fisiologiche di flusso, fintantoché non sono terminati i processi di rimodellamento cellulare che porteranno alla rigenerazione di un nuovo tratto arterioso. La possibilità di avere un biomateriale in grado di essere rimodellato in vivo rappresenta l’evento fondamentale per ottenere una protesi vascolare ideale.

34. Non sono stati ancora sviluppati sostituti arteriosi di 2 mm di diametro con adeguate caratteristiche meccaniche per ottenere risultati a lungo termine. John D. Kakisisa, Christos D. Liapis, Christopher Breuer and Bauer E. Sumpio. Artificial blood vessel: The Holy Grail of peripheral vascular surgery. Journal of Vascular Surgery; Volume 41, Issue 2 , February 2005, Pages 349-354 Scopo della nostra ricerca è mettere a punto una protesi vascolare riassorbibile in grado di guidare in vivo la rigenerazione di un’arteria di piccolo diametro.

35. MEDICINA RIGENERATIVA Induzione in vivo di un nuovo organo o tessuto con le stesse proprietà fisiologiche dell’organo perduto. La medicina rigenerativa è il nuovo obiettivo della ingegneria dei tessuti Scaffold riassorbibile In grado di orchestrare in vivo gli eventi rigenerativi Che viene completamente riassorbito a rigenerazione avvenuta

36. “INTELLIGENT” TEMPORARY VASCULAR CONDUIT ABAT: Artery Bio-regeneration Assit Tube HYAFF 11™ Length: 1 cm Diameter: 2mm 30 Wistar rats Abbiamo utilizzato un biomateriale che avesse la sola funzione di guida temporanea per i processi di rigenerazione e rimodellamento vascolari. In grado quindi di promuovere ed ordinare la rigenerzione della parete vascolare nel sito anatomico di impianto. IN VIVO TISSUE ENGINEERING APPROACH

37. L’acido ialuronico è ben conosciuto per la sua biocompatibilità, biodegradabilità e per la sua capacità di promuovere l’adesione e proliferazione delle cellule endoteliali. Remuzzi A, Mantero S, Colombo M, Morigi M, Binda E, Camozzi D, Imberti B. Vascular smooth muscle cells on hyaluronic acid: culture and mechanical characterization of an engineered vascular construct. Tissue Eng. 2004;10(5-6);699-710. Turner NJ, Kielty CM, Walker MG, Canfield AE. A novel hyaluronan-based biomaterial (Hyaff-11) as a scaffold for endothelial cells in tissue engineered vascular grafts. Biomaterials. 2004;25(28);5955-5964. Tonello C, Vindigni V., Zavan B, Brun P., Abatangelo S., Abatangelo G. and Cortivo R. In vitro reconstruction of an endothelialized skin substitute provided with microcapillary network using biopolymer scaffold. FASEB J. 12.07.05, 2005 (on line).

38. 1 cm 1 cm 1 cm b c 1 cm ABAT a d e Le protesi tubolari (HYAFF-11™ tubules, 2 mm diameter, 1 cm length) sono state innestate a livello dell’aorta addominale di 30 ratti.

39. 2 mm 2 cm ABAT AORTA ADDOMINALE Impianto della protesi

40. 5 GIORNI e f g ↓CD133+/CD34+/VEGFR-2+ vWF VEGFR-2 CD34 Cellule Endoteliali Progenitrici Circolanti E’ evidente la positività del lume interno, a marcatori quali vWF e VEGFR-2 per le cellule endoteliali ed al CD34 per le cellule progenitrici.

42. 15 GIORNI • Cellule positive per il vWF tapezzano il nuovo lume vascolare • Le cellule endoteliali sono anche evidenziate dalle indagini di microscopia • elettronica

43. 30 GIORNI Il biomateriale è ancora integro ed il nuovo tessuto vascolare scorre dall’anastomosi prossimale a quella distale, sia lungo la superficie interna che esterna della protesi.

44. A 180 giorni dall’impianto il biomateriale è completamente riassorbito. • La nuova arteria mantiene la propria struttura e • le proprietà meccaniche. Il lume è pervio senza • segni di dilatazione o collasso. • Il biomateriale è assente e sostituito dal nuovo • tessuto avventizio

45. Conclusioni Seguendo i principi della ingegneria dei tessuti è possibile ottenere un sostituto cutaneo composito, originato dalla co-cultura di differenti popolazioni cellulari autologhe. Il biomateriale a base di acido ialuronico è risultato essere un valido substrato per supportare la crescita e la differenziazione di cheratinociti, fibroblasti e cellule endoteliali.

46. Conclusioni Il trattamento delle perdite di sostanza cutanea di diversa eziologia con un sostituto cutaneo provvisto di una rete microcapillare dovrebbe favorire l’integrazione in vivo del sostituto ed incrementare la velocità e qualità della guarigione.

47. Conclusioni • Per quanto riguarda la rigenerazione in vivo è possibile guidare i processi biologici utilizzando opportuni scaffolds. Protesi che agiscono come semplici guide biologiche e che consentono alle cellule mesenchimali vascolari di scorrere lungo il supporto senza infiltrarlo; • Protesi vascolari di piccolo calibro pronte da utilizzare senza l’utilizzo di cellule o precondizionamenti biochimici; Protesi in grado di essere degradate completamente dopo 4/5 mesi senza provocare alcun effetto collaterale.

48. Le cellule possono essere isolate da un frammento di tessuto e separate in base alle loro caratteristiche Prelievo e selezione della componente cellulare CHERATINOCITI FIBROBLASTI CELLULE ENDOTELIALI ADIPOCITI … Hanno caratteristiche differenti a seconda della sede anatomica di prelievo

49. NICCHIE BIOLOGICHE CHERATINOCITI

50. Cellule staminali ed ingegneria dei tessuti Prendiamo in esame alcuni casi applicativi. Il primo è la rigenerazione della cute