Western blot 实验技术

Western blot 实验技术

定义： • 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 • 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 • 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法

Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。

Western Blot一般流程 • 蛋白样品的制备 • SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 • 转膜 • 封闭 • 一抗杂交 • 二抗杂交 • 底物显色

蛋白样品的制备 • 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 • 水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0 • 有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 • 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白

蛋白样品的定量 Bradford法考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。(上样量) 试剂：考马斯亮蓝工作液，0.1N盐酸，双蒸水，蛋白标准液（将10mg/ml蛋白溶液稀释至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。）

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理： SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素

凝胶成份 • 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺  • SDS • 配胶的Tris缓冲液 • TEMED • 过硫酸铵(时间) • Tris-甘氨酸电泳缓冲液

凝胶浓度与蛋白分离范围

转膜价格便宜硝酸纤维素膜简单快速封闭非特异性抗体结合膜的选择封闭非特异性抗体结合麻烦尼龙膜价格昂贵需要更高的蛋白结合率（尼龙膜： 480µg/cm2；硝酸纤维素膜：80µg/cm2）特殊要求下的选择目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱需要更大的机械强度

转膜半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。

转膜后检测 • 丽春红S染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。 • 印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的 Western印迹过程。

封闭 • 脱脂奶粉（5％） • BSA • Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）

一抗、二抗孵育 • 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37℃一小时，4 ℃过夜。 • 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 • 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37℃一小时，4 ℃过夜。 • 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。

二抗与底物反应显色 • 辣根过氧化物酶法（HRP） • 碱性磷酸酶法（AP） • 化学发光显色法(HRP)

Western Blot常见问题分析

SDS-PAGE电泳 • 胶板洗刷干净 • 加入APS和TEMED的量要合适 • 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 • 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 • 两块玻璃板底部要对齐 • 胶不平？ • 凝胶漏液？

凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 • 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 • 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 • 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适 • 条带比正常的窄？ • “微笑”或“倒微笑”条带？

转膜及抗体检测 • 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min • 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 • 确保膜和胶块之间没有气泡 • 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温 • 凝胶肿胀或卷曲？ • 条带歪斜或漂移？ • 单个或多个白点？ • 转膜缓冲液过热？

原因 • 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 • 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 • 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 • 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 • 膜没有均匀浸湿 • 膜或者缓冲液污染 • 封闭不充分 • 抗体与封闭剂出现交叉反应 • 抗体浓度过高对策背景太高

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