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第 12 章 遗传工程

第 12 章 遗传工程. 本章教学时数： 2 学时。 本章重点：基因工程的基本流程。 本章难点：分子标记和基因图谱； 研究基因功能的方法. §1 遗传 工程概述. 遗传工程： 细胞工程 酶工程 发酵工程 基因工程. 遗传工程的概念. 遗传工程 （ genetic engineering）， 也称生物工程（ biological engineering）。 是指利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或更适合人类需求的产品的遗传学手段。. 广义遗传工程和狭义遗传工程：.

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第 12 章 遗传工程

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  1. 第12章 遗传工程

  2. 本章教学时数：2学时。 • 本章重点：基因工程的基本流程。 • 本章难点：分子标记和基因图谱； 研究基因功能的方法

  3. §1遗传工程概述 遗传工程： 细胞工程 酶工程 发酵工程 基因工程

  4. 遗传工程的概念 • 遗传工程 （genetic engineering），也称生物工程（biological engineering）。 • 是指利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或更适合人类需求的产品的遗传学手段。

  5. 广义遗传工程和狭义遗传工程： • 广义：包括细胞工程、基因工程、酶工程和发酵工程等。 • 狭义：基因工程。

  6. 细胞工程 • 在离体（in vitro）条件下以细胞为基本单位，借助人工培养基，对生物细胞进行培养、繁殖，或者使其发生变异，从而改良生物品种、创造新品种、加速繁育，或利用细胞培养生产有用物质的过程。 • 细胞工程包括细胞培养、细胞融合、细胞器转移、生物体的克隆与规模化繁殖等。

  7. 第一个哺乳动物的克隆——Dolly羊

  8. 酶工程 • 利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品。 • 是酶学理论与化工技术相结合的新技术体系。

  9. 发酵工程 • 利用微生物与现代化工程技术相结合，工厂化生产人类需要的物质的一种技术体系。 • 目前医用抗生素、农用抗生素绝大部分都是发酵工程产品。

  10. 基因工程 • 利用人工方法在体外（in vitro）切割、拼接、重组生物的遗传物质，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改良。 • 基因工程操作的对象是DNA分子。 • 又称为重组DNA技术

  11. 重组DNA技术流程

  12. §２ 基因工程的工具酶 • 内切核酸酶(endonuclease) • DNA连接酶(ligase) • DNA聚合酶（DNA polymerase） • RNA聚合酶（RNA polymerase） • 反转录酶（reverse transcriptase） • 最重要的工具酶是限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）

  13. 限制性内切核酸酶 • 或称限制性酶(restriction enzyme),是基因工程最重要的工具。 • 在细菌中这些酶的功能是降解外来DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染。 • 这类酶能识别双链DNA分子中特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双连DNA分子切断。

  14. Eco R Ⅰ

  15. 限制性内切核酸酶的命名原则： • 根据分离出这种酶的细菌在分类学上的属名、种名和菌株名来命名。 • 名称的第一个字母是该细菌的属名的第一个字母，大写，斜体。 • 名称的第二、三个字母是该细菌种名的前两个字母，小写，斜体。 • 名称的第四个字母是菌株的名称，大写或小写，正体。如果没有菌株名称就不写。 • 名称最后的是罗马数字，表示从这种细菌中分离出来的酶的序号，如从某个菌株中分离出来的第一种酶为Ⅰ，第二种酶为Ⅱ，等等。

  16. 如EcoRⅠ来自大肠杆菌（Escherichia coli）R菌株，读作echo-r-one； • Hind Ⅲ 来自流感噬血杆菌 （Hemophilus influenzae）d菌株,读作hind-three

  17. 限制酶的分类 • 限制性核酸内切酶的工作分为2个步骤： 识别特定的DNA序列 在特定的位置切割DNA分子 • 根据其作用特点,可以将限制性酶分为三种类型： Ⅰ型 Ⅱ型 Ⅲ型。 • 在基因工程中用途最广泛的是Ⅱ型限制酶。

  18. Ⅰ型限制酶 • 有特定的识别序列 • 但切割位置远离识别位置 • 有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割DNA分子 • 在基因工程中没有什么用途

  19. Ⅲ型限制酶 • 有特定的识别序列 • 切割位置在识别序列3’端相距20bp处，可以产生各种类型的单链末端。 • Ⅲ型限制酶在基因工程中有特定的用途，但总体来说，用途不大。

  20. Ⅱ型限制酶 • 在DNA上有特定的识别序列 • 而且其切割位点就在识别序列内部 • 基因工程中用途最广 • 识别序列是对称的，在一条链中从5’到3’方向的序列与其互补链从5’到3’方向的序列完全相同，称为回纹对称序列(palindrome)。

  21. 酶切与连接

  22. 常见内切酶

  23. DNA连接酶(DNA ligase) • 共价连接5′－磷酸和3′－OH，形成磷酸二酯键(3′－5′phosphodiester bond)，封闭DNA双链上的缺刻(nick)。

  24. 反转录酶reverse transcriptase

  25. §3 载体(vector) • 将外源DNA片段运送进宿主细胞(host cell)进行扩增或表达的运载工具称为载体。 • 载体也是DNA分子。

  26. 常用载体： • 细菌质粒、噬菌体、病毒等。 • 都要经过人工改造。 • 细菌人工染色体（BAC） • 酵母菌人工染色体（YAC） • 人类人工染色体（HAC）

  27. 载体的基本条件 ①有独立的复制原点(ori)，能独立地自我复制，而且能带动外源DNA一起复制。 ②具有多种限制性酶的切点，用于连接外源DNA 片段。 ③载体上的限制酶酶切位点对于任何一种限制酶来说只能有一个。 ④具有一个选择标记基因。

  28. 质粒载体①分子量小(2.69kb),但能携带较大的外源片段；②拷贝数多,在每个宿主细胞可达500个；③酶切位点多，克隆方便；④具有α-互补显色表型,便于检测。质粒载体①分子量小(2.69kb),但能携带较大的外源片段；②拷贝数多,在每个宿主细胞可达500个；③酶切位点多，克隆方便；④具有α-互补显色表型,便于检测。

  29. 互补显色反应

  30. λ噬菌体（30kb）

  31. 粘粒（cosmid）载体（45kb）

  32. 细菌人工染色体BAC（300kb）bacterial artificial chromosome 来源于F因子

  33. YAC（1Mb）yeast artificial chromosome

  34. Ti质粒 • Ti质粒是根癌农杆菌的染色体外遗传物质 • 双链闭合环状DNA，150～200kb • 植物基因工程常用的载体

  35. Ti质粒结构 • T-DNA Transfer DNA • 是农杆菌侵入植物细胞时从Ti质粒上转移到植物细胞的一段DNA • T-DNA两端个有一段25bp的同向重复序列，是T-DNA的边缘区 • LB；RB • 在同一条单链的LB和RB内各形成一个缺口，单链T-DNA进入植物细胞

  36. §4基因的分离与鉴定 从基因库中分离基因 聚合酶链式反应(PCR)扩增基因 人工合成基因 T－DNA标签法

  37. (一)从基因库中分离基因 1．构建基因库 2．筛选基因库 3．阳性克隆的分析与鉴定

  38. 1．构建基因库 • 基因库 (library)是一组DNA或cDNA序列克隆的集合体。 • 创建基因文库的目的是从特定的材料中分离目的DNA片段或基因。 • 把所有的基因集中在一个库中，采用一定的方法在库中筛选目的基因。 • 同时也便于基因的长期保存。

  39. 基因组文库 Genomic DNA library • 使用与切割载体相同的限制酶，将供体生物的基因组DNA切割成许多片段 • 将所有片段连接到载体上，构成一个重组DNA群体 • 这个群体包含全基因组的遗传信息

  40. cDNA文库 • cDNA library • 以mRNA为模板，经反转录酶合成互补DNA(complementary DNA，cDNA) • 将双链cDNA与适当载体连接 • 转化到宿主细胞内进行扩增，建成cDNA文库

  41. 基因组文库与 cDNA文库的比较： • 基因组文库包含基因组的所有基因 • cDNA文库只包括某一特定细胞类型、某一组织、或某一发育时期的表达序列 • 分离特定基因，cDNA库比较方便 • 研究调控序列，必须基因组文库

  42. 从基因库中筛选特定的克隆 • 一个基因文库中有几万个克隆，目的基因到底在哪个克隆上呢？ • 根据待选基因相关信息 确定筛选方法和条件。 • 最常用的方法是利用一段核苷酸序列作探针，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，筛选基因库

  43. DNA探针（probe） • 探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列 • DNA、cDNA、寡聚核苷酸 • 单链、双链 • 同位素标记、荧光标记、颜色标记

  44. 筛选文库 • 质粒基因库筛选 • 细菌混合液在培养在平板上 • 转移到尼龙膜上 • 裂解细菌 • 变性DNA • 标记探针 • 杂交 • 漂洗 • 放射自显影或荧光检测 • 挑取对应菌落、培养 • 抽提质粒

  45. 阳性克隆的分析与鉴定 • 从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因 • 测序 自动测序仪 • 功能分析 预测软件

  46. 核酸序列测定的原理

  47. 磷酸二脂键

  48. 测序电泳图谱

  49. 核酸序列分析与功能预测 • 同源性比较 • 同源基因是指那些起源相同、序列相似的基因。 • 可从核酸及蛋白质两种水平比较基因间的同源性。 • 将测出的核酸序列同杂交的探针序列进行比较 • 将得到的序列发到BLAST等DNA Data库的网址上比较

  50. 开放阅读框（open reading frame, ORF）分析 • 开放阅读框：一段能编码一条多肽链，并具有翻译起始信号（ATG）和终止信号 (TAA、TAG或TGA)的核苷酸序列。 • 来自cDNA库的序列可直接进行0RF分析，比较其与其他序列的同源性来确定其身份。 • 来自核基因库的序列，因大多数真核生物基因含有内含子。

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