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工具酶

工具酶. 和. 载体. 第四章 工具酶 工具酶 基因工程技术中能用于 DNA 和 RNA 的合成、连接、切割和修饰的各种酶。 包括： 限制酶 , 核酸酶 . 聚合酶 , 连接酶 , 激酶 , 磷酸酶 ,.

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工具酶

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Presentation Transcript

  1. 工具酶 和 载体

  2. 第四章 工具酶工具酶基因工程技术中能用于DNA和RNA 的合成、连接、切割和修饰的各种酶。包括：限制酶,核酸酶.聚合酶, 连接酶, 激酶, 磷酸酶,

  3. 第一节 限制性内切酶（Restriction Endonuclease）一. 细菌的限制一修饰现象被发现瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论：核酸内切酶降解细菌外源DNA,修饰酶保护自身DNAArber首次从 E.Coli B菌株中分离出Ⅰ型限制酶EcoB美Hopkings大学 H.Smith从流感嗜血菌中分离 Ⅱ型 限制酶 Arber, Smith获得1978 年Nobel奖

  4. 二.限制酶系统分类和命名1985年后大量限制酶被发现，已从350多种微生物中发现2000多种限制酶，识别108种不同的特定序列限制性内切酶的分类 Ⅰ型: 特异识别、随机切割 Ⅱ型：特异识别、同点切割Ⅲ型：特异识别、异地切割 通常所指的限制酶即Ⅱ类酶

  5. 限制酶特性比较I型II型 III型限制与修饰由同一酶承担 是 否 是酶反应辅助因子 ATP.mg++ SAM mg++ ATP.mg++SAM 识别位点特性 / 4-6bp回文对称 / 切割位点 距离>1kb 识别点中 距3端24-26bp举例 EcoB BamHI EcoPL 识别位点 TGAN8TGCT G GATTC AGACC 克隆工作中用途 无 有 无SAM: 硫一腺苷甲硫氨酸

  6. 三.系统命名法 限制性内切酶的命名方法属名 种 变种 序数 1字母 2字母 1字母 (EcoRI) E co R I (HindIII)H in d III (BamHI) B am H I

  7. 四.一般限制酶的识别特点1.大多数是严格的识别顺序，少数可变2.识别顺序的碱基数一般为4-6 bp，少数识别更长3.多数识别位点具有旋转对称性，少数的识别位 点在切割位点之外，具旋转对称性

  8. 4bp HpaⅠ C  CGG HaeⅢ GG  CC 5bp Ava Ⅱ G GWCC EcoRⅡ  CCWGG 6bp BamHⅠ G  GATTC SmaⅠ CCC  GGG11bp Bg1Ⅰ GCCNNNN NGGC 12bp BstXⅠ CCANNNNN NTGCN=A, T, G, C

  9. 五. 限制酶的切割末端5粘端 （EcoR I） 3粘端 （Pst I） 平端 （Sma I）六.限制酶产生的末端的连接1.匹配粘端: 直接连接2. 平末端: 万能连接3. 不匹配粘端： S1 Nuclease切去突出端 或Klenow补平

  10. 七.识别位点与切割方式之间的关系1.识别不同，切割不同eg: BamHI EcoRI -G GATC  C- - A  GATCT- -C  CTAG G- - T CTAG  A-2.识别不同，切割产生末端相同(同尾酶)eg: BamHI Bg1Ⅱ - A  GATCT -G  GATCC - T CTAG  A -CCTAG  G

  11. 3.识别相同，切割不同 eg: SmaI XmaI -CCC  GGG- -C  CCGG -GGG  CCC- -G GGCC  C-4．识别相同，切割相同──同工酶 同裂酶 eg: HpaⅡ Msp Ⅰ -CCGG- -C * C  GG- -GG  CC- -G G  CC-

  12. 八.限制酶反应的影响因素1.温度：一般37C，有例外,如：SmaI 25C，BclI 50C，TaqI 65C2.缓冲液：高、中、低盐之分 (NaCl) 3. 时间：1-1.5小时4. 反应体积和甘油浓度：酶<1/10体积5. DNA纯度与构型：

  13. (1）纯度：RNA，蛋白，氯仿，SDS，EDTA，EB，酚，乙醇，硫酸根，DNA(2)构型：切超螺旋需更多的酶 例: lg  DNA, EcoRI 切, 1U超螺旋 pUCl9, EcoRI 2.5U HindⅢ 5U Sal I 10U Nar I 20U

  14. 酶单位的定义：1U：50ul反应体积中，1小时内酶完全切割1ug DNA所需要的酶量缓冲液NaCl 0, 50, 100mmol/L离子强度Tris-HCl pH7.5-8.0 MgCl2激活因子DTT 保护还原性基因

  15. 近末端的切割：eg: AccI GGTCGACC  切不动CGGTCGACCG 切不动 CCGGTCGACCGG 切不动eg: EcoRI GGAATTCC CGGAATTCCG 2小时内90%完全酶切eg: PmeI GTTTAAAC 20小时不能切GGTTTAAACC 20小时，25%切开GGGTTTAAACCC 20小时，50%切开AGCTTTGTTTAAACGGCGGCCGG 20小时，90%切开

  16. 星号反应(Star Activity)识别专一性下降eg: EcoRI GAATTC EcoRI* AATT原因：甘油浓度过高，酶浓度太大， 离子强度不适，pH不适(Ph>8.0)存在有害试剂(>1%乙 醇, DMSO, 乙二醇)阳离子变化:Mn++, Co++, Zn++, Cu++代替mg++

  17. 酶的灭活 1.加热 2.酚抽提

  18. 第二节 修饰酶一.分类细菌DNA聚合酶 *E. Coli DNA聚合酶（全酶） *Klenow酶T4噬菌体DNA聚合酶T4噬菌体DNA聚合酶 *测序酶（修饰的T7 pol） *Taq DNA聚合酶 *反转录酶 末端脱氧核苷酸转移酶 依赖于DNA的RNA聚合酶SP6噬菌体RNA聚合酶 T3噬菌体RNA聚合酶T4噬菌体RNA聚合酶

  19. 连接酶E. Coli DNA连接 *T4 DNA连接酶T4噬菌体 RNA连接酶 激酶T4噬菌体多核苷酸激酶 磷酸酶 *碱性磷酸酶 核酸酶Ba131核酸酶 S1核酸酶 绿豆核酸酶RNaseA RNaseT1 DNaseI EXoⅢ 噬菌体外切核酸酶

  20. 二.聚合酶1.E. Coli DNA聚合酶活性:（1）53DNA聚合酶活性 （2）35核酸外切酶活性 （3）53核酸外切酶活性主要用途：切口平移法标记DNA

  21. 3. T4 噬菌体DNA聚合酶活性：（1）53聚合酶活性 （2）35外切核酸酶活性, 比 Klenow酶强200倍用途: 3’突出端切平4. T7噬菌体DNA聚合酶活性： 53聚合酶活性很强, 无35外切核酸酶活性主要用途：修饰后用于测序5. Taq酶耐热(75--80 C)的DNA聚合酶专用于PCR

  22. 6.逆转录酶：AWV (源于鸟成髓细胞白血病病毒)，Mo-MLV(源于Moloney鼠白血病病毒)活性：(1)53聚合酶活性(2) RNaseH活性(Mo-MLV小,cDNA得率高)主要用途：(1)反转录cDNA (2) 标记5突出端（补平）(3) 测序

  23. 四.连接酶T4 DNA连接酶连接：粘端，平端，dsDNA中的切口， 杂交体连接五.碱性磷酸酶 包括细菌碱性磷酸酶(BAP)和小肠碱性磷酸酶(CIP), 虾碱性磷酸酶(SAP)用途:去除DNA、RNA、NTP、dNTP的5磷酸根

  24. 六.核酸酶1.DNA酶为DNA内切核酸酶,水解单链或双链用途:(1)缺口平移标记探针时产生随机切口(2)降解DNA2.RNA酶内切核糖核酸酶,专用降解RNA六.核酸酶1.DNA酶为DNA内切核酸酶,水解单链或双链用途:(1)缺口平移标记探针时产生随机切口(2)降解DNA2.RNA酶内切核糖核酸酶,专用降解RNA

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