Coral bleaching under thermal stress: putative involvement of host/symbiont recognition mechanisms

1. Coral bleaching under thermal stress: putative involvement of host/symbiont recognition mechanisms A. AIGLE, M. BARTOLOME et C. RIBEREAU M1 BEM, UE 227 FLUC D’après JeremieVidal-Dupiol et al., 2009 Pocillopora damicornis

2. Matériels et Méthodes Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Introduction Résultats Résultats blog-ecologie.fr 3 dernières décennies : augmentation de la fréquence et de l’amplitude de ces perturbations : naturelles + anthropiques  Réchauffement climatique Blanchiment des coraux Forte mortalité maxisciences.com Récifs coralliens : • Biodiversité et complexité écologique • Haute production primaire • Valeur écologique et économique considérable Ex: 1998, mort de 16% des coraux du monde

3. Matériels et Méthodes Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Introduction Résultats Résultats • Cause = stress environnementaux : augmentation anormale des • températures + forte irradiance solaire. • Origine physiologique : • Rupture de la symbiose mutualiste phototropheentre l’hôte • (scléractiniaire) et l’endosymbionte (dinoflagellé) Au niveau moléculaire : 1er effet = photoinhibition  surproduction de ROS (toxiques)  perte du symbionte par : • nécrose et apoptose • digestion in situ du symbionte par l’hôte • exocytose / « pincement » • détachement de la cellule hôte • Nombreuses études pour tenter de comprendre les mécanismes moléculaires de réponse au stress.

4. Matériels et Méthodes Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Introduction Résultats Objectif : Identifier les gènes intervenant dans les 1ères étapes du stress thermique (avant le blanchiment) à l’origine de l’arrêt de la symbiose  biomarqueurs de la « santé » des coraux.

5. Matériels et Méthodes Introduction Discussion Conclusion Résultats Matériel biologique utilisé et protocole de stress thermique Espèce étudiée : Pocillopora damicornis. • 46 nubbins répartis en deux groupes (stressé et contrôle) + acclimatation à 28°C.  • Mise en place du protocole de stress thermique déclenchant in situ un blanchiment de masse.  Lombok Carte de l’Indonésie et localisation du site de prélèvement. Photo d’un groupe de nubbins (expérience de thermotolérance). Schéma du protocole de stress thermique.

6. Matériels et Méthodes Introduction Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Résultats Résultats EXPERIENCES REALISEES ET BUTS : • Expérience de suivi du blanchiment : • Déterminer à quel moment s’effectue la rupture de symbiose. (2) Hybridation soustractive suppressive : • Construction de banques d’ADNc induisant / réprimant le blanchiment. (3) Séquençage EST + analyses BLASTX et BLASTN : • Sélection et caractérisation des gènes d’intérêt. (4) Q-RT-PCR : • Déterminer, à différents stades du stress thermique, la quantité de transcrits pour les gènes d’intérêt. (5) RACE-PCR (rapid amplification of cDNA ends) : • Caractériser l’ORF (extrémité 3’ et 5’ des ADNc) des ADNc candidats dans le but de construire les amorces spécifiques des gènes correspondants. (6) PCR croisées sur l’holobionte (hôte + symbionte) et deux espèces de Symbiodinium en culture pure : • Déterminer quel organisme (hôte ou symbionte) exprime les gènes candidats. (7) Expériences d’immunolocalisation : • Déterminer la zone d’expression, chez Pocillopora damicornis, des gènes candidats.

7. Matériels et Méthodes Introduction Résultats Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Lot stressé Lot contrôle Diminution de 79,9% Arrêt de la symbiose Densité de Symbiodiniumspp pendant une période de stress. Suivi du blanchiment : StresséContrôle 15 j : début du blanchiment pas de blanchiment 18j : blanchiment total

8. Matériels et Méthodes Introduction Résultats Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion 2 gènes spécifiques trouvés :appartiennent à la classe fonctionnelle cellule / cellule ou cellule / ligand. • Pdcyst-rich:similarité avec des protéines impliquées dans l’adhésion cellulaire.  Domaine fonctionnel connu (motif cystéine)  Protéine fonctionnelle ?  similarités avec Nematostella vectensis • PdC-Lectin :domaine DC SIGN: lectines de type C • Domaine fonctionnel connu (protéines extracellulaires des Métazoaires (CTLD)) • Protéine fonctionnelle ?  Similarités avec la protéine Millectine (Acropora millepora). • Reconnaissance et liaison avec des mannoses Ca²⁺ dépendantes ?  Exclusivement chez le scléractiniaire

9. Matériels et Méthodes Introduction Résultats Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Diminution de la transcription Densité de symbiontes Pdcyst-rich PdC-Lectin Taux de transcription de PdC-Lectin et Pdcyst-rich en parallèle avec l’indicateur classique du blanchiment Suivi du taux d’expression

10. Matériels et Méthodes Introduction Résultats Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Schéma général de l’anatomie de P. damicornis. Schéma d’une coupe histologique au niveau des polypes de P. damicornis Immuno-marquage de PdC-Lectin au niveau des cellules endodermales du tissu oral des polypes.

11. Matériels et Méthodes Introduction Résultats Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Schéma général de l’anatomie de P. damicornis. Schéma d’une coupe histologique du coenosarc chez P. damicornis Immuno-marquage de Pdcyst-rich dans les cellules calicoblatsiques

12. Matériels et Méthodes Introduction Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Résultats Discussion Originalité de cette étude :conditions « naturelles » (amplitude et rapidité de l’augmentation des températures). 2 gènes isolés : Down regulation • Pdcyst-rich Problème : domaine fonctionnel commun à un grand nombre de protéines  différentes fonctions. • Expression + stockage : ectoderme calicoblastique. HYPOTHESE :Rôle possible dans les processus de minéralisation et de calcification ? • Concordance entre les effets du stress (arrêt de croissance et calcification) et la diminution de la transcription. • Étude récente chez Montastraea faveolata.

13. Matériels et Méthodes Introduction Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Résultats Discussion • PdC-Lectin • Alignement + analyse structurale  valide la fonction de PdC-Lectin: reconnaissance et liaison de mannose Ca²⁺ dépendantes. HYPOTHESE : Rôle dans l’acquisition et la séquestration du symbionte • Plusieurs travaux surles lectines (Acropora millepora, Laxus oneistu, Fungia scutaria) tendent à valider cette hypothèse. • Zone d’expression : endoderme en contact avec les symbiontes + interface hôte / symbionte • Recrutement et acquisition par interaction avec les ligands mannose du symbionte ?

14. Matériels et Méthodes Introduction Conclusion Résultats Discussion • Obtention d’un biomarqueur fonctionnel de stress thermique : évaluer la santé descolonies. • Mise en évidence d’un nouveau mécanisme hypothétique du blanchiment = diminution de la séquestration et de l’acquisition des Symbiodinium.

15. Matériels et Méthodes Introduction Conclusion Résultats Discussion • Autre étude : blanchiment = réponse immunitaire innée de l’hôte contre les symbiontes (suite à la production de ROS) exocytose + apoptose. • Millectine :rôle dans la réponse immunitaire innée+ séquestration des Symbiodinium (Kvennefors ECE et al., 2008). • CTLD invertébrés :première structure de la reconnaissance du non soi + défense humorale (Alex N. Zelensky and Jill E. Gready, 2005) + acquisition / séquestration des Symbiodinium (Jeremie Vidal-Dupiol et al., 2009). • Remarques : • Vocabulaire : ‘zooxanthelle’ • Discussion PdC-Lectin : emballement ? • Rôle du symbionte ? Relation mutualiste

16. Bibliographie • J. Vidal-Dupiol, M. Adjeroud, E. Roger, L. Foure, D. Duval, Y. Mone, C. Ferrier-Pages, E. Tambutte, S. Tambutte, D. Zoccola, D. Allemand, G. Mitta, 4/08/2009, Coral bleaching under thermal stress: putative involvement of host/symbiont recognition mechanisms, BMC Physiology 9:14. • Alex N Zelensky1 and Jill E Gready, Août 2004, C-type lectin-like domains in Fugu rubripes. BMC Genomics. • Alex N. Zelensky and Jill E. Gread, Octobre 2005, The C-type lectin-like domain superfamil. FEBS Journal. • Charneau Sébastien, Janvier 2005, Approches moléculaires des mécanismes mis en jeu en fin de schizogonie intraérythrocytaire de Plasmodium falciparum (agent du paludisme) par Hybridation soustractive suppressive et Puce à ADN (Matériel et méthodes). • E.C.E. Kvenneforsa, W. Leggata,c, O. Hoegh-Guldberga, B.M. Degnanb, A.C. Barnesa, 11/06/2008, An ancient and variable mannose-binding lectin from the coral Acropora millepora binds both pathogens and symbionts, Developmental and Comparative Immunology (2008) 32, 1582–1592. • Kvennefors, E. Charlotte E., Leggat, William, Kerr, Caroline C., Ainsworth, Tracy D., Hoegh-Guldberg, Ove, and Barnes, Andrew C. (2010) Analysis of evolutionarily conserved innate immune components in coral links immunity and symbiosis. Developmental and Comparative Immunology, 34 (11). pp. 1219-1229. ISSN 1879-0089. • S. Bulgheresi, I. Schabussova, T. Chen, N.P. Mullin, R.M. Maizels, J. A. Ott, Avril 2006, A New C-Type Lectin Similar to the Human Immunoreceptor DC-SIGN mediates Symbiont Acquisition by a Marine Nematode, Envir. Microbiology p. 2950–2956 Vol. 72, No. 4. • V.M. Weis, Cellular mechanisms of Cnidarian bleaching: stress causes the collapse of symbiosis, 6/08/2008, The Journal of Experimental Biology 211, 3059-3066. • Vimal Julien, mai 2007, Physiopathologie des coraux.

18. Matériels et Méthodes Introduction Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Résultats Résultats Schémas x : Schémas de présentation de la technique SSH (Supression Subtractive Hybridisation)

19. Matériels et Méthodes Introduction Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Résultats Résultats Schémas x (suite) : Schémas de présentation de la technique SSH (Supression Subtractive Hybridisation)

20. Matériels et Méthodes Introduction Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Résultats Résultats (9) Seconde PCR suppressive : utilisation des amorces imbriquées • Augmentation de la concentration en séquences différentielles (e). • Diminution de l’enrichissement en séquences de base (b). (10) Clonage des produits PCR et construction de quatre banques d’ADNc BIG : gène induisant le blanchiment (x2). BRG : gène réprimant le blanchiment (x2). Schémas x (suite) : Schémas de présentation de la technique SSH, résultats de la première PCR suppressive.