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实时荧光定量 PCR 原理与应用

实时荧光定量 PCR 原理与应用. 代文涛 技术支持 北京东胜创新生物科技有限公司. 2002 年 4 月成立 , 专注于生命科学领域的高科技公司 总部设于北京，在全国 16 个主要城市设有分支，销售及售后服务网络覆盖全国 致力于为客户提供高技术、高质量、全方位的专业服务 拥有自主研发中心. 东胜创新生物科技有限公司 Eastwin Life Science inc. 郑州办. 南宁办. 高速的渠道扩张. 哈尔滨办. 公司总部 北方区总部 北京分公司. 长春办. 乌鲁木齐办. 沈阳办. 呼和浩特办. 大连办. 石家庄办. 济南办. 青岛办.

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实时荧光定量 PCR 原理与应用

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Presentation Transcript

  1. 实时荧光定量PCR原理与应用 代文涛 技术支持 北京东胜创新生物科技有限公司

  2. 2002年4月成立,专注于生命科学领域的高科技公司2002年4月成立,专注于生命科学领域的高科技公司 总部设于北京，在全国16个主要城市设有分支，销售及售后服务网络覆盖全国 致力于为客户提供高技术、高质量、全方位的专业服务 拥有自主研发中心 东胜创新生物科技有限公司Eastwin Life Science inc.

  3. 郑州办 南宁办 高速的渠道扩张 哈尔滨办 公司总部 北方区总部 北京分公司 长春办 乌鲁木齐办 沈阳办 呼和浩特办 大连办 石家庄办 济南办 青岛办 兰州办 南通办 南京办 西安办 太原办 华东区总部 上海分公司 武汉办 合肥办 杭州办 重庆办 南昌办 温州办 成都办 2002.4 福州办 长沙办 2002.8-11 厦门办 华南区总部 广州办 昆明办 2003.1-4 2004.5-6 东胜国际 东胜创新香港分公司 2005.1-12 筹建中

  4. 高速的团队发展 东胜创新创建于2002年4月，3年多的时间，成就了一个业界一流的渠道商和服务商，书写了业内企业高速发展的传奇！

  5. 高速的团队发展 公司现有员工近200人，其中具备本科以上学历者占85%，并拥有一支完全由博士、硕士组成的30多人的强大技术队伍； 教育背景 行业背景 行业背景则包括麦肯锡公司、波士顿咨询公司、GE等国际知名公司以及国家人类基因组南方研究中心、上海生物芯片国家工程研究中心、中科院、珠海百奥生物技术工程公司等国内生物行业的学术中心及知名企业。 人员教育背景涵盖了中国科学院、北京大学、清华大学、南京大学、复旦大学等国内几乎所有主要知名院校以及美国哈佛大学、哥伦比亚大学、芝加哥大学、香港大学等多所国际知名院校。

  6. 高速的业绩增长 • 年复合增长率高达78% • 不断扩大的市场份额 • 不断丰富的产品线 单位：百万美元

  7. 东胜创新自产品牌 2006 2006 2005 2004 2003 2002

  8. 东胜创新实验技术有限公司Eastwin Scientific,Inc. 东胜创新实验技术有限公司（东胜实验）是东胜创新旗下又一新兴品牌，她和东胜创新生物科技有限公司（东胜生物）一起，为广大客户提供高品质的服务。 东胜实验致力于打造一家提供全品类试剂、耗材和实验室通用仪器，集电子商务、配送上门、专业服务为一体的集成式渠道商。公司将首期投入5000万元，二期投入3亿元，以品类齐全、价格低廉、到货快捷、服务专业四大优势，真正成为客户科研工作中的亲密伙伴！

  9. 东胜实验部分合作厂商

  10. 全——一站式服务：品类齐全，购置方便 • 联合AXYGEN、FALCON、QIAGEN、WHEATON等众多国内外著名厂商 • 涵盖实验通用仪器、试剂、耗材三大类，数千万种产品 • 专业的产品搜索引擎和电子商务平台（www.bio168.net），提供在线订购、电话订购、上门订购三种灵活模式，让您的采购更加便捷，实现真正的一站式服务

  11. 平——优惠的价格和丰富的客户回馈计划 • 优惠的价格体系和丰富的客户回馈计划，让您在节省经费的同时，体验更多超值惊喜

  12. 快——高效的物流配送：现货储备，到货快捷 • 上亿元常规备货，确保现货供应 • 在全国建设3大配送中心，150个配送站，超过5000个配送终端 • 采用先进的GPS和RFID物流控制系统，保证到货的及时和安全

  13. 专——后顾无忧：技术领先，服务专业 • 由多位博士、硕士组成的专业技术队伍，全面解决您在实验中遇到的技术难题；此外，我们通过与厂商联合，及时引进先进技术与您分享

  14. 基本原理 • 实验体系的建立 • 应用

  15. S1 S2 M DNA Engine 常规PCR 常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终产物进行定性分析

  16. lens 荧光定量PCR 通过实时检测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现快速定性或者对起始模板进行定量分析的一种技术手段。 • 如何对初始模板定量 • 荧光信号如何产生？

  17. 阈值线 Ct值 C(t) value C(t) value 18.12 +/ - 0.04 Threshold line Ct值 如何对初始模板定量？ Ct值的概念 • CT值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段时，达到一个人为确定的阈值所对应的循环次数。

  18. 荧光定量PCR原理 • 理想的PCR反应： • X=X0*2n • 非理想的PCR反应： • X=X0 (1+Ex)n • n：扩增反应的循环次数 • X：第n次循环后的产物量 • X0：初始模板量 • Ex：扩增效率 • XCt=X0 (1+Ex)Ct =N log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log N 原理：初始模板量的对数值与C(T) 值之间 呈线性关系

  19. 为什么要引入Ct值 相同样品在一台PCR仪上同条件下重复96次的扩增曲线图 • Ct值则极具重现性，可稳定反应起始模板量 • 终点产物量不恒定，因此终点定量不准确

  20. 荧光定量分析原理

  21. 荧光定量技术的发展简史 • 1992年第一次报告提出：EB染色，激发、检测装置，观察PCR反应过程 • PCR反应动力学公式演算推导，借助标准曲线定量 • 1994年第一篇Real time PCR文献正式发表 • 1995年世界第一台商品化的荧光定量PCR仪诞生

  22. 荧光信号如何产生？ 荧光化学试剂 • SYBR Green 1 • Molecular Beacons • TaqMan

  23. SYBR Green I SYBR Green 1

  24. A C G A T G C C G T T G A T C T G A G G A G T G A C A C A C T C A C T C SYBR Green I 工作原理 • SYBR Green 1结合到双链DNA的小沟部位 • SYBR Green 1染料和双链DNA结合后荧光信号大大增强。 荧光信号值与扩增产物量成正比

  25. SYBR Green I 熔解曲线分析 • 荧光强度的变化是由于 • 温度不断升高 • 双链DNA解离，SGI游离 • Tm是熔解曲线的特征值

  26. Amplicon Non-specific product 融解曲线的作用 • 判断PCR产物的特异性； • 排除非特异性扩增产物的干扰

  27. SYBR Green I 优点 • 使用方便 ——不必设计复杂的荧光探针 • 便宜 • 灵敏

  28. Molecular Beacons Molecular Beacons 发夹型杂交探针

  29. Molecular Beacons 环 环与目标序列完全配对 茎 茎由互补配对的序列组成 荧光素 淬灭剂

  30. Molecular Beacons 目标序列 A C G A A C G A T C C T G G T T T G C G G A A T T A G A G C A C 茎 T A C T C Q 荧光素 淬灭剂

  31. Molecular Beacons 应用范围 • 鉴定PCR产物(定性） • 定量起始模板浓度 • 单核苷酸多态性（SNP）检测

  32. Molecular Beacons 优缺点 • 有很高的特异性， 用于SNP检测 • 荧光背景低 • 设计困难 • 一个探针只能用于检测一个特定的目标 • 价格较贵

  33. TaqMan探针 TaqMan 荧光素 探针 淬灭剂 水解型杂交探针

  34. TaqMan探针工作原理 3’ 5’ 3’ 5’

  35. TaqMan 应用范围 • 鉴定PCR产物(定性） • 定量起始模板浓度 • 单核苷酸多态性（SNP）检测

  36. TaqMan 优缺点 • 特异性好， 适合于SNP检测 • 与 Molecular Beacons 相比设计相对简单 • 价格较高 • 一个探针只能用于检测一个特定的目标 • 背景比分子信标探针高

  37. 信号检测 主要应用范围 化学试剂 工作原理 有否淬灭剂 结合于双链DNA的小沟中 定量 融解曲线分析 否 延伸 发夹型杂交探针 SNP分析 定量、定性 有 复性 • 水解型杂交探针（5‘-3’外切） SNP分析 定量、定性 任何 步骤 有 荧光化学试剂总结

  38. 荧光定量实验体系的建立 使用SYBR Green I染料 标准曲线如何制作 常规PCR体系 • PCR产物、质粒DNA • OD260定量 • 分子量计算 • 拷贝数换算 • 10倍系列稀释液 SGI 荧光定量PCR体系

  39. SYBR Green I的稀释 原液10倍稀释于DMSO，可长期储存 使用前100倍稀释于纯水 SYBR Green I的保存 SYBR Green I的原液十分稳定 稀释后-20度可保存半年 避光，避免反复冻融 SYBR Green I试剂盒 Bio-Rad Finnzyme Qiagen等 SYBR Green I

  40. SYBR Green I实验程序 • 1. 94 ℃ 5 min • 2. 95 ℃ 10 sec • 3. 58 ℃ 30 sec • 4. 72 ℃ 20 sec • 5. Plate read • 6.82 ℃ 30 sec • 7. Plate read • 8. Goto step 2 for more 39 times • 9. Perform melting curve from 55.0 ℃ to 95.0 ℃,read every 0.2 ℃, hold for 1 sec

  41. 不同读板温度对实验结果的影响：72℃

  42. 不同读板温度对实验结果的影响：82℃

  43. 荧光定量实验体系的建立 使用TaqMan探针 • 探针、引物的设计 • 引物反应条件的优化 • 加入探针进行预实验 • 标准曲线的制作 探针设计软件：Primer express、Beacon designer

  44. TaqMan探针及引物设计原则 • GC含量30－80％ • 5’端避免出现重复的G碱基 • 探针的退火温度68－70 探针设计 • 先设计探针，再设计引物 • 正向引物与探针的距离 • 尽量避免重复的G出现 • 退火温度58－60，低于探针10 引物设计

  45. TaqMan实验程序 • 1. 94 ℃ 5 min • 2. 95 ℃ 10 sec • 3. 58 ℃ 30 sec • 4. Plate read • 5. Goto step 2 for more 39 times • 6. end

  46. 荧光定量实验条件的优化 • 扩增片段的长度 • 引物浓度：0.1－0.5uM（建议HPLC纯化） • 产物特异性－－融解曲线分析、DNA电泳 • 退火温度的优化－－温度梯度功能 • MgCl2浓度的调节 • 助解链剂DMSO的使用（<5%）

  47. 荧光定量PCR技术的应用

  48. 基因表达差异 • 直接得出拷贝数，再计算表达差异（标准曲线） • ddCt (有内参基因） • dCt (无内参基因）

  49. 基因表达差异 直接计算法 ERBB2的表达（正常组织vs. 肿瘤组织） • 目标基因：ERBB2 oncogene • 内标基因：GAPDH • 模板 • 从 正常乳腺组织中提取的 Total RNA • 从乳腺癌组织中提取的 Total RNA • 含 ERBB2 and GAPDH 质粒用于生成标准曲线

  50. 取材差异 提取效率差异 反转录效率差异 内标引入的必要性 内标基因的选择 • 原则：内标基因在不同组织或者 处理前后表达量不变 • 内标基因的选择 一般选取GAPDH、 β-actin、18sRNA

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