HEMOLYTICKÉ ANÉMIE

1. HEMOLYTICKÉ ANÉMIE HEMOLYTICKÉ ANÉMIE Michal Folwarczny Interní oddělení NsP Havířov

2. Fyziologie Korpuskulární podmínky 1. Membrána 2. Metabolismus 3. Vnitřní struktura - hemo-globin Extrakorpuskulární podmínky 1. Fyzikální 2. Chemické 3. Biologické - cizí - vlastní Erytrocyt za IDEÁLNÍCH PODMÍNEK přežívá 120 dní

3. Fyziologie ANÉMIE HEMOLÝZA - intravaskulární - extravaskulární HEMOLYTICKÁ ANÉMIE HEMOLYTICKÝ SYNDROM Atlas fyziologie člověka, S.Silbernagel

4. DEFEKT VNITŘNÍ MEMBRÁNY ČI METABOLISMU Enzymopatie Hemoglobinopatie Talasemie ZTRÁTA INTEGRITY MEMBRÁNY, CYTOSKELETU Hereditární sferocytóza, eliptocytóza… Paroxyzmální noční hemoglobinurie Imunitní a lékově vázané HA ZEVNÍ FAKTORY Mechanické trauma, Mikroangiopatické vlivy Chemické, fyzikální a biologické vlivy

5. Klinické projevy - obecně

6. Laboratorní algoritmus 3 ZÁKLADNÍ OTÁZKY 1. Průkaz hemolýzy 2. Typ hemolytického mechanismu 3. Konečná diagnóza

7. KO mikroskopicky RTC, retikulocytový index nekonjugovaný bilirubin urobilinogen a hemoglobin v moči hyperplastická erytropoéza, vysoký počet sideroblastů, polychromázie, bazofilní tečkování erytrocytů haptoglobin v séru hemopexin v séru (hemosiderin v moči) Průkaz hemolýzy

8. Hemolytický mechanismus Přímý antiglobulinový test Testy na Coombs negativní HA Vyš. Hb v moči Volný Hb v séru

9. Osmotická rezistence po 24 hodinové inkubaci při 37°C Nestabilita při 45°C Screening G-6-PD Aktivity enzymů: především pyruvát-kináza Měření glutathionu Kryohemolytický test Elektroforéza Hb - Měření HbA2, HbF a jiné Přesná diagnóza Při podezření na vrozenou hemolytickou anémii Průkaz proteinů erytrocytové membrán /spektrin atd./ a cytoskeletu gelovou elektroforézou nebo RIA

10. Přesná diagnóza Při podezření na autoimunitní HA Přímý a nepřímý antiglobulinový test Specifikace antierytrocytárních protilátek Titrace chladových aglutininů Donath-Landsteiner test Průkaz teplotního optima protilátek Eluční testy

11. Přesná diagnóza Při podezření na polékový mechanismus Skríningové vyš. pro G6PD Vyš. glutationové stability Barvení na Heinzova tělíska Průkaz methemoglobinu Průkaz sulfhemoglobinu Vyš. na drug-dependent protilátky

12. Přesná diagnóza Při podezření na mechanickou příčinu Morfologie erytrocytů Počet trombocytů Koagulační skrínink V nejasných případech Vyš. pro PNH: acidifikační test – Hamův test, test lýzy po přidání glukózy, průtoková cytometrie, gelový test Měření přežívání erytrocytů značeným chromem Určení místa hemolýza metodami nukleární medicíny

13. Hereditární sferocytóza Incidence 1/2500-1/5000 AD (vzácně recesivní) onem. s variabilní expresivitou genu – variabilní klinika DIAGNOSTIKA: - různé počty sférocytů, různě těžká norm.norm an. ,není přítomná anizocytóza - KD – hyperplazie eryrtropoézy, příležostně megaloblastoidní rysy - osmotická rezistence ery snížená - autohemolýza je zřetelně zvýšená a snižuje se po přidání glukózy /ne ATP/ • známky extravaskulární hemolýzy • kryohemolytický test KOMPLIKACE: - HEMOLYTICKÁ KRIZE A APLASTICKÁ KRIZE

14. Hereditární sferocytóza Prenatální diagnostika osmotickou fragilitou Near-total splenectomy Hledání korelace genotyp-fenotyp v rámci výběru vhodné strategie

15. Erytrocytární enzymopatie

16. Erytrocytární enzymopatie DEFEKT ENZYMŮ ANAEROBNÍ GLYKOLÝZY → deficity pyruvát kinázy – chronická hemolytická anémie s malým efektem splenektomie DEFEKT ENZYMŮ PENTOSOVÉHO CYKLU → deficit glukoso-6-fosfát dehydrogenázy - zvýšená citlivost k oxidačním činidlům – chronická hemolýza či hemolytická krize – anémie s Heinzovými tělísky

17. Defekt pyruvátkinázy • chronická nesfrerocytová HA, autozomálně recesivní • vyšší výskyt v severní a střední vropě • PŘÍTOMNÁ ANÉMIE JE VĚTŠINOU DOBŘE TOLEROVÁNA - • METABOLICKÝ BLOK NASTÁVÁ AŽ ZA VZNIKEM 2,3-DPG • vysoce variabilní průběh – lehký ikterus po těžkou aplasticou krizi • DG: převaha normocytárních, někdy lehce makrocytární • RTC středně nebo lehce zvýěšené • Polychromázie, anizocytóza, ojed. normoblasty • Test autohemolýzy je patologický, úprava po ATP • Diagnóza se opírá o průkaz snížené aktivity enzymu. • TH: Symptomatická terapie • Transfúze, splenektomie, chelatace • Raritní dřeňová transplantace

18. Defekt G-6-PD • vazba na X chromozom, nedostatečná tvorba NADPH → porušení • NEDOSTATEČNÁ OXIDAČNÍ OCHRANA ERYTROCYTŮ VEDE K • AKUTNÍM HEMOLYTICKÝM EPIZODÁM, VZÁCNĚJI KE CHRONICKÉ HEMOLÝZE • DG: Heinzova tělíska – barvení briliant kresylovou modří • Test autohemolýzy – zlepšení po glu i ATP • Pozitivní methemoglobinový redukční test, mol-gen vyš. • Screening: fluorescenční test – nedostatek redukované formy NADPH • TH: vyvarovat se oxidačním vlivům

19. HEMOGLOBINOPATIE → vrozené, geneticky podmíněné poruchy primární poruchy hemoglobinových řetězců 1. THALASÉMIE /α,β/ 2. CHOROBY Z ABNORMÁLNÍCH HEMOGLOBINŮ Časté: HbS, HbC, HbD Punjab, HbE Vzácné: familiární Velká množství variant hemoglobinu, zvláště ty, které zasahují řetězce gama nebo delta, nemusí mít žádný klinický význam. Některé tyto hemoglobinopatie jsou však spojeny s hemolýzou, případně s polyglobulií a/nebo cyanózou

20. Talasémie BETA • porucha syntézy β globinového řetězce, 11. chromozóm → precipitace nadbytečných α-řetězců – poškození membrány – hemolýza Erytropoéza je výrazně infefektivní, velká část erytrocytů zaniká ještě v kostní dřeni, současně je přítomná i periferní hemolýza se zkráceným přežívaním erytrocytů - výrazná kompenzatorní hyperplazii erytropoézy → uzurace kortikalis →deformity kostí, fraktury, extramedulární hemopoéza

21. Talasémie BETA • u β0-talasemie tvorba řetězců zastavena úplně • u β+-talasemie tvorba řetězců snížená Thalassemia minor /heterozygotní/ • většinou klinicky němá, náhodný záchyt • Hb kolem 100g/L, mikrocytární, mikrochromní • hladina HbA2 je zvýšená na 3,5 až 8,0 %, HbF rovněž lehce zvýšena Thalassemia major /mohozygotní nebo dvojitě heterozyg./ Těžký průběh. Jsou-li ery schopny syntetizovat γ řetězce – HbF se silnou afinitou ke kyslíku – těžká tkáňová hypoxie Výrazná kompenzatorní hyperplazie erytropoezy při současné zvýšené zásobě Fe z rozpadlých ery – rozvoj přetížení železem Typické změny na skeletu „hair-on-end“, facies thalassemica, splenomegalie, důsledky přetížení železem

22. Talasémie BETA Diagnostika KO: hypochromní mikrocytární anémie, drepanocyty, bazofil.tečkování KD: výrazná hyperplazie erytropoezy Biochemie:↑ přímý i nepřímý bilirubin, ↑ Fe v séru, ↑ feritin v séru ELFO hemoglobinu: ↑ HbA2 ↑HbF Molekulárně genetické metody Terapie Transfuze erytrocytů, chelatační léčba Transplantace krvetvorných buněk Stimulace tvorby HbF /hydroxyurea, fenylbutyrát/ Prevence Vyšetření amniotické tekutiny DNA analýzou

23. Tvorba α-řetězců kódována v diploidní erytroidní buňce 4 geny – 2 lokusy na každém z obou 16. chromozomů Talasémie ALFA -α/αα Mikrocytóza, bez anémie Tiché nosičství /silent carrier/ Alfa-thalassemia minor • --/αα Mikrocytóza, hypochromie, lehká anémie Choroba hemoglobinu H • --/-α Anémie v 1.roce života, kostní změny Choroba hemoglobinu Barts • αα/αα Hydrops fetalis

24. Hemoglobinopatie Abnormální hemoglobiny Polycytémie – tkáňová hypoxie s cyanozou Srpkovitá anémie – HbS, HbC, HbD, HbE Nestabilní hemogloginy Kongenitální nesferocytární HA s tvorbou Heinzových tělísek Methemoglobinémie Stabilizace hemového Fe v trojmocné podobě Hemoglobiny se zvýšenou afinitou k O2

25. Hemoglobinopatie Abnormální Hb většinou vznikají záměnou 1 AMK zbytku v některém globinovém řetězci Diagnostika: ELFO Hb Identifikace abnormálního Hb tryptickým štěpením Testy tepelné stability /isopropanol/, tvorby Heinz. tělísek Testy na methemoglobin, vyšetření afinity k O2 Molekulární genetika Nestabilní hemoglobiny Hb Olomouc Hb Hradec Králové Hb Haná

26. Srpkovitá anémie Dědičná hemolytická anémie (β6Glu → Val) Polymerizace HbS → srpkovitý tvar ery → vazo-okluzivní krize V některých částech Afriky až 45% nosičů Homozygotní formy – symptomatické Heterozygotní – asymptomatické – prevence Plasmodium falciparum Klinika: anémie, splenomegalie, venookluzivní krize, hand-foot syndrome, bolestivé krize, přihody CNS, acute chest syndrome HEMOLYTICKÉ KRIZE: aplastická forma, krize ze sekvestrace ve slezině Diagnostika: těžká anémie, normocyt., normochrom., ↑ RTC, někdy i leukocytóza, trombocytémie, anizocytóza, poikilocytóza, terčovité ery, Howell-Jollyho tělíska, v případě autosplenektomie i normoblasty Bohatá kostní dřeň, známky extravaskulární hemolýzy, snížená osmotická rezistence, zvýšená hodnota HbF

27. Srpkovitá anémie TERAPIE Prevence krizí sprkovatěním Zkouší se léky zvyšující hladinu HbF – např. hydroxyurea Perspektivně translantace KD Genetické poradenství

28. Paroxyzmální noční hemoglobinurie ZÍSKANÉ, NEMALIGNÍ KLONÁLNÍ onemocnění pluripotentní kmenové bunky s intravaskulární hemolýzou, hyperkoagulací a relativní dřenovou insuficiencí Somatická mutace PIG-A genu (porucha syntézy GPI kotvy nutné pro vazbu CD 59 a CD 55, kt.chrání buňky před účinkem komplementu- C3b a C8b) PIG –A gen se nachází na X chr., ale PNH se vyskytuje jak u mužů tak u žen.

29. hemoglobinurie po spánku (ne po noci) nepravidelné hemolýzy vyvolané infekcí, menstruací, transfuzí, operací, vakcinací… těžká trombóza krvácivé symptomy (15%) infekční komplikace (vzácně) Paroxyzmální noční hemoglobinurie intravaskulárni hemolýza erytrocytů granulocytopénieindukované C3b C8b trombocytopénie žilní trombózy – atypické lokalizace (C3b a C8b indukuje prokoagulační enzymatické komplexy na povrchu destiček) sideropénie (hemoglobinurie a hemosiderinurie)

30. Paroxyzmální noční hemoglobinurie KREVNÍ OBRAZ A LABORATORNÍ NÁLEZY: anémie, zvýšené retikulocyty, granulocytopénie, trombocytopénie, zvýšený volný Hb v plazmě, snížený haptoglobin, hemopexin, zvýšený nepřímý bilirubin, zvýšená LDH MOČ: hemoglobinurie, hemosiderinurie KOSTNÍ DŘEŇ: hypercelulární forma se zvýšenou erytropoézou hypocelulární až aplastické formy Hamův test Hartmanův test Průtoková cytometrie Gelová mikroaglutinace Molekulárně – genetické vyšetření Hemosiderin v moči

31. Paroxyzmální noční hemoglobinurie • KURATIVNÍ • allogenní transplantace KD (10-20% riziko spontánních • remisí při protrahovaném průběhu) • PŘI MASIVNÍ HEMOLÝZE • kortikoidy (Prednison) • transfuze ery masy (deleukotizované) • U APLASTICKÉ FORMY • imunosupresiva (cyklosporin) a ATG

32. Paroxyzmální noční hemoglobinurie • Progrese do těžké aplastické anémie • 20-30% aplastických anémii přechází v PNH • Závažné trombozy 20% (u gravidních ve 40% letální) • Akutní leukémie 5% • Spontánní uzdravení 1/3 • Medián přežití 10 až 15 let • Příčinou úmrtí : 10% dřenový útlum • nejčastěji trombózy

33. Paroxyzmální noční hemoglobinurie • Blokátory aktivace komplementu – Eculizumab

34. Extrakorpuskulární HA IMUNITNÍ Alloprotilátky Autoprotilátky

35. Extrakorpuskulární HA NEIMUNITNÍ

36. Neimunitní získané HA Mechanické a fyzikální vlivy Vadná srdeční chlopeň, pochodová hemoglobinurie, mikroangiopatické hemolytické anémie, rozsáhlé popáleniny Jaterní choroby, Hypofosfatémie, hereditární lipoproteinémie, povvýživa, nadbytek mědi, Wilsonova choroby Metabolické příčiny Chemické látky oxidační činidla, hadí jedy Infekce přímá infekce erytrocytů: malárie aj. septikémie /Clostridium perfringens aj./, Leptospiry, Borelie

37. MAHA Příčina Rozrušení integrity membrány erytrocytu mechanickou příčinou v průsvitu cévy, nejčastěji depozity fibrinu v místě poškození endotelu cévní stěny: vaskulitidy, akutní glomerulonefritis, po SCT, nádory, operace chlopní, AV malformace, léky – cyklosporin, tiklopidin, cévní protézy, hemangiomatosa → fragmentace krvinek – schistocyty- zvýšený zánik ve slezině, při masivní hemolýze – intravaskulární hemolýza při současné aktivaci koagulačního systému – DIC s tvorbou mikrotrombů v cirkulaci Klinický obraz Dán kombinací Coombs negativní hemolytické anémie, trombocyto-pénie a přítomnosti mikrotrombů (CNS, ledviny)

38. MAHA Laboratorní nález Anémie s retikulocytózou, schistocyty, akantocyty, sférocyty, trombocytopenie se známkami DIC, nález multimerů při elfo vWF při TTP, molekulárně genetické vyšetření u TTP. Zvýšen přímý i nepřímý bilirubin v séru, zvýšená LDH, proteinurie, Hb-urie, zvýšen volný Hb, Kr, Ur Léčba Léčba vyvolávající příčiny, u TTP/HUS plasmafaréza se substitucí čerstvou zmrazenou plasmou, kortikoidy, antikoagulancia, transfuse erytrocytů

39. AIHA Hemolytické stavy způsobené protilátkami namířenýmiproti vlastním erytrocytům organismu • Porucha kooperace mezi supresorickými a pomocnými T lymfocyty a B lymfocyty, jež se uplatňují v procesu imunitního dozoru dysregulace tohoto systému vede k nedostatečné supresi tvorby protilátek proti vlastním antigenům či paradoxně ke stimulaci jejich tvorby ZÁKLADNÍ MOMENT V PATOGENEZI AIHA

40. AIHA TEPELNÉ PROTILÁTKY - IDIOPATICKÁ - SEKUNDÁRNÍ /lymfoproliferace, jiné nádory, autoimunitní choroby, virové infekce, imunodeficience/ - HEMOLYTICKÁ ANÉMIE INDUKOVANÁ LÉKY CHLADOVÉ PROTILÁTKY - IDIOPATICKÁ - SEKUNDÁRNÍ /lymfoproliferace, viry, mykoplazmata, autoimunitní choroby/ paroxyzmální chladová hemoglobinurie /lues, spalničky aj./ SMÍŠENÉ CHLADOVÉ A TEPELNÉ PROTILÁTKY

41. AIHA ZÁKLADNÍ MOMENT V PATOGENEZI AIHA Porucha kooperace mezi supresorickými a pomocnými T lymfocyty a B lymfocyty, jež se uplatňují v procesu imunitního dozoru dysregulace tohoto systému vede k nedostatečné supresi tvorby protilátek proti vlastním antigenům či paradoxně ke stimulaci jejich tvorby

42. AIHA LABORATORNÍ NÁLEZ KO: makrocytární anémie s retikulocytózou Biochemie:↑ přímý i nepřímý bilirubin ↑ urobilinogen v moči Speciální vyšetření: přímý a nepřímý antiglobulinový test (Coombsův test) PRŮKAZ INTRAVASKULÁRNÍ HEMOLÝZY ↑ volný Hb v plasmě ↓ hladiny haptoglobinu a hemopexinu v séru, hemoglobinurie

43. PŘÍMÝ ANTIGLOBULINOVÝ TEST Proprané erytrocyty jsou inkubovány se zpravidla králičími protilátkmami proti lidským imunoglobulinům /IgG nebo IgM/ anebo proti C3d složce komplementu. Po centrifugaci je odečítána přítomnost aglutinace, ke které dochází jen v přítomnosti IgG či C3d na membránach testovaných erytrocytů

44. NEPŘÍMÝ ANTIGLOBULINOVÝ TEST Prokazující přítomnost autoprotilátek v séru pacienta. K erytrocytům známého antigenního složení je přidáno sérum pacienta a provedena inkubace při 37°C, teprve v dalším kroku testu jsou přídány protilátky proti lidskému imunoglobulinu a po centrifugaci je hodnocena aglutinace.

45. Tepelné protilátky • IgG charakter – optimální vazba při 37°C • Vychytávání erytrocytů s navázanou protilátkou makrofágy sleziny vazbou na Fc fragment s Fcγ receptorem makrofágů EXTRAVASKULÁRNÍ HEMOLÝZA • Při vysokém titru protilátek – možnost aktivace komplementu INTRAVASKULÁRNÍ HEMOLÝZA

46. Chladové protilátky • IgM charakter – optimální vazba při 4°C • Vazba ne erytrocyt v chladnějších akrálních partiích s možností aktivace komplementu, aglutinace komplementu • INTRAVASKULÁRNÍ HEMOLÝZA • Při méně pevné vazbě dochází k uvolnění protilátek v oblastech s vyšší teplotou aniž došlo k lýze erytrocytů, • vychytávání erytrocytů makrofágy sleziny vazbou s C3b složkou komplementu fixovanou na erytrocytech • EXTRAVASKULÁRNÍ HEMOLÝZA • IgM charakter – optimální vazba při 4°C

47. Sekundární AIHA s tepelnými protilátky AUTOIMUNITNÍ CHOROBY SLE, revmatoidní artritis, sklerodermie, UC, AFS HEMATOLOGICKÉ NÁDORY chronická lymfadenóza, maligní lymfomy, vzácné akutně leukémie JINÉ NÁDORY karcinomy, thymom, Kaposiho sarkom, teratomy INFEKCE EBV, HIV-1,2, HCV, vakcinace /difterie-pertuse-tetanus/ IMUNODEFICITNÍ STAVY Kongenitální a získané hypogamaglobulinenemie a dysgamaglobulinemie

48. Polékové hemolytické anémie Imunitní mechanismy polékové hemolýzy

49. Polékové hemolytické anémie HA asociována s omeprazolem Am. J.Gastroenterology 1991, Marks DR Těžká Coomb´s pozitivní HA

50. Algoritmus terapie IgG HA PREDNISONE IVSPLENECTOMYIMMUNOGL.PLASMAFERESA ASSESSSEVERITY WATCH MINIMAL MARKED MODERATE PREDNISONE60mg/d NO YES SPLENECTOMY REDUCE TO 20mg/d RESPONSE NO RESPONSE CYCLOPHOSPHAMIDEAZATHIOPRINRITUXIMAB REDUCE TO 5-10mg/d