利用重組酵母菌報導基因試驗法檢測臺灣河川中類戴奧辛物質

1. 利用重組酵母菌報導基因試驗法檢測臺灣河川中類戴奧辛物質 廖猛崴，成功大學環境工程研究所碩士班研究生 張哲維，成功大學環境工程研究所碩士 周佩欣，成功大學環境工程研究所助理教授 計畫編號：NSC-98-2221-E-006-020-MY3

2. 摘要 戴奧辛對生物體所產生的毒性，主要是經由芳香烴受體（Aryl hydrocarbon receptor, AhR）所誘發。類戴奧辛物質為能與AhR結合之物質，其結構可能與戴奧辛類似，並藉由與AhR結合而對人體或是其他生物產生多種毒性反應。本研究為調查台灣河川受類戴奧辛物質污染之狀況，於特定流域採樣並利用轉殖入人類AhR/Arnt基因之酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）進行類戴奧辛生物毒性試驗分析。初步篩選出含有類戴奧辛物質的樣本，並以逆相式高效率液相層析儀（Reverse phase-High performance liquid chromatography, RP-HPLC）分離之，以進一步探討不同採樣點中會結合AhR之化合物是否相同。另外亦透過液相層析串聯式質譜儀等儀器，嘗試鑑定主要會與AhR結合之污染物質。 實驗結果顯示鹽水溪流域之類戴奧辛物質當量濃度較其它各個流域要來的高。鹽水溪流域中下氲之豐化橋、太平橋、鹽水溪橋所採水樣具有較高之類戴奧辛物質當量濃度，其中又以枯水期間於豐化橋所測得的數值為最高，類戴奧辛當量濃度高達14.9 ± 2.1 nM β-NF-equivalent。此外，以類戴奧辛生物毒性試驗法分析經液相層析儀分離後之分段樣本，判定不同採樣點中並非為同樣之污染物質會與AhR結合。 關鍵字：重組酵母菌報導基因試驗法、類戴奧辛物質、芳香烴受

3. 前言 在現今科技發達的時代，各式各樣的污染物藉由各種型式排放到環境中。新興污染物（Emerging contaminants, ECs），定義為「新認定」或「之前未確認」的污染物，包含：界面活性劑及其殘留物、個人護理用品、汽油添加劑、塑化劑及各種工業添加劑等。其中會與細胞的核內受體作用，進而干擾內分泌系統之物質稱為內分泌干擾物質（Endocrine disruptive chemicals, EDCs），此類物質會干擾生物內分泌系統的合成、分泌、傳導、結合與作用，影響生物內分泌系統與生殖系統的平衡，以及生物的發展或行為（Said Kinani et al., 2010, Mazurová et al., 2008）。常見細胞核內受體有會與類雌激素結合之雌激素受體（Estrogenreceptor, ER）及會與類雄激素結合之雄激素受體（Androgen receptor, AR）等。 戴奧辛由鹵化芳香烴碳氫化合物（Halogenated aromatic hydrocarbons, HAHs）及其它同類型的物質所組成，如多氯二聯苯戴奧辛（Polychlorinated dibenzo-p-dioxins, PCDDs）、多氯二聯苯呋喃（Polychlorinated dibenzofurans, PCDFs）、及多氯聯苯（Polychlorinated biphenyls, PCBs）（Piia Leskinena et al., 2008）。。

4. 藉由與芳香烴受體（Aryl hydrocarbon receptor, AhR）之結合，戴奧辛可能會造成免疫系統毒性、神經毒性與致癌性，並阻礙個體發展及影響生殖能力。類戴奧辛物質之定義為其它會與AhR結合之物質，這些物質亦可能藉由AhR調節基因表現的機制誘發出毒性。環境中的類戴奧辛物質主要來自於人類活動的副產物，如工業廢水、污水處理廠放流水以及其它來源（E. Mazurová et al., 2008, C.-H. Koh et al., 2004），排入環境的主要途徑為大氣傳輸或是廢水排放（C.-H. Kohet al., 2004），一旦進入食物鏈可能會造成生物累積與生物放大等作用（Steffen Keiter et al., 2008）。 本研究之主要目的為建立一套快速、方便、成本低廉且可有效分析環境中類戴奧辛物質的生物檢測流程。所使用之生物檢測法為轉殖入人類AhR/Arnt基因與報導基因質體之重組酵母菌試驗法，利用該檢測法結合儀器分析調查台灣河川受類戴奧辛物質污染之現況，並嘗試找出主要誘導活性之類戴奧辛污染物質

5. 材料與方法 1. 樣本取得 採樣方式以在橋上使用繩子綁水桶方式，向下撈取河川之表層水，儲存於1 L的PE廣口瓶中。記錄採樣的日期、氣溫、水溫、pH值、導電度等資訊，並以GPS之TW2座標標記採樣地點。水樣攜回實驗室後於4℃下保存，並在一天內完成水樣前處理。各個河川採樣地點參考全國環境水質監測資訊網公布之水質與採樣地點等資料，針對臺灣北、中、南部等主要河川進行採樣(表1)，表1中編號遞增表示上氲往下氲順序排列。 2. 藥品與試劑 前處理中所使用的溶劑、逆相式高效率液相層析儀所使用的甲醇、二甲基亞碸溶劑、及生物檢測實驗使用之標準品β-萘黄酮（β-Naphthoflavone , β-NF）均向MERCK公司所購買，所製備的濃度範圍為1 nM至1 mM。所有進行生物檢測的標準品與樣本均溶於二甲基亞碸中。 3. 樣本前處理 前處理過程包括（1）過濾（2）固相萃取（3）溶液置換與稀釋序列配置。

6. （1） 過濾 將1 L的水樣利用水流抽氣幫浦過濾，採用保留粒徑為0.60 μm之玻璃纖維濾紙（GS-25, ADVANTEC, Japan）以過濾水樣中的懸浮固體物。 （2） 固相萃取以3 mL的甲醇與3 mL的二段水調理全新的固相萃取匣（Sep-Pak Environmental C18 Cartridges, Waters, USA）後，將固相萃取匣接上蠕動幫浦，並以4 mL/min的流速使水樣通過兩個串聯的固相萃取匣。以5 mL的二段水清洗萃取完的固相萃取匣後，用3 mL的甲醇與1 mL的二甲基亞碸沖提之，分別以1 mL的體積收集於4個小型離心管中。 （3） 溶液置換與稀釋序列配置 使用真空離心濃縮機於溫度40℃、轉速為4000 rpm、壓力為－100 kPa的狀態下蒸乾樣本，以1 mL的二甲基亞碸溶解萃取出之固體物。因原始水樣體積為1000 mL，故定義該濃縮液之濃縮倍率為環境濃度之1000倍。以此樣本依序製備200、100、40、8 與1.6等濃縮倍率之稀釋序列。

7. 中華民國九十九年十一月十二、十三日 屏東縣國立屏東科技大學環境工程與科學系 4 淡水河 烏溪 北氱溪 急水溪 曾文溪 日期 編號 採樣地點 日期 編號 採樣地點 日期 編號 採樣地點 日期 編號 採樣地點 日期 編號 採樣地點 2010 07/13 DS1 新海橋 2009 09/12 W1 烏溪橋 2009 12/11 BG1 土庫大橋 2009 09/11 JS1 急水溪橋 2010 01/27 TW1 北勢州橋 DS2 華江橋 W2 大肚橋 BG2 和平橋 JS2 鐵線里 TW2 麻善大橋 DS3 忠孝橋 W3 中彰大橋 BG3 北氱大橋 JS3 宅氱橋 TW3 西氱大橋 DS4 迪化污水廠 PZ1 東海橋 BG4 雲嘉大橋 JS4 二氱橋 TW4 國姓大橋 DS5 百齡橋 PZ2 逢甲橋 JS5 五王大橋 DS6 重陽橋 PZ3 倡和橋

8. 4. 逆相式高效率液相層析儀（RP-HPLC）分離樣本 逆相式高效率液相層析儀所使用的管柱為Shim-pack FC-ODS 3 μm column（4.6×150 mm Shimadzu, Japan），為了進一步分離具有高AhR活性之物質，自環境濃度1000倍的樣本中取20 μL注入HPLC，利用沖提液的極性變化來達到物質分離的目的。沖提之初始條件為90%二段水與10%甲醇之溶液組成，以線性梯度的方式調整沖提溶液比例，於第20分鐘到達100%甲醇，第20分鐘至第40分鐘固定為100%甲醇。沖提液流速為0.8 mL/min，初始管柱壓力約82 kg/m2，管柱使用溫度為40℃，偵測器偵測波長為254 nm。樣本收集時間為40分鐘，每1分鐘收集一個分段樣本。 5. 液相層析串聯式質譜儀（LC-MS/MS）分析 以自動進樣器注射5 μL待測物溶液至管柱，動相為去離子水與0.1 M的甲酸/氰甲烷＝6/4 (v/v)，以每分鐘0.2 mL的流速進行層析。氲離源採用電子噴霧氲離源，使用負離子模式（ES－）。使用管柱為Shim-pack XR-ODS 2.2 μm column（3.0×75 mm Shimadzu, Japan），沖提流速為0.2 mL/min，霧化氣體為氮氣，碰撞氣體為氰氣，以離子源溫度130℃、溶媒揮散溫度與流速分別為180℃與700 L/h的條件下操作。

9. 6. 基因重組酵母菌試驗法（YCM3 AhR assay） 本實驗所使用的基因重組酵母菌係以基因轉殖的方式殖入人類AhR/Arnt基因於酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）的染色體中，並殖入pTXRE5-Z的報導質體於細胞內。當類戴奧辛物質與AhR/Arnt結合後，此複合體會與特定的基因序列（Xenobiotic responsive elements, XRE）結合，誘發下氲LacZ基因表現產生β-半乳糖酵素，將o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside（ONPG）代謝呈色，此酵母菌試驗稱為YCM3 AhR assay。本實驗使用之酵母菌為美國Miller博士開發（Miller, 1999），由日本京都大學松田知成教授提供。實驗流程為將酵母菌於培養液中以30℃培養18小時後，取0.5 mL菌液與19.3 mL的培養液混合，再取198 μL移入96-well Microplate的各well 中，並分別添加2 μL的標準品β-NF、空白樣品（二甲基亞碸）以及樣本的稀釋序列進行試驗，每個樣品均做三重複。於30℃下再培養12小時後量測595 nm吸光值，取出10 μL菌液移入新的Microplate中，並加入190 μL的Z-buffer與ONPG，於37℃下反應1小時後量測405 nm吸光值。 7. 數值計算與分析 β-NF標準曲線係以四參數法近似劑量反應曲線後，計算所得之最佳近似曲線，四參數法公式如式（1）（Nording et al., 2006），實驗中所使用的標準品其R-square值均大於0.9。

10. 結果與討論 1. 各河川AhR活性 各河川AhR活性經YCM3 AhR assay檢測結果如圖一所示，由圖可知，在環境濃度下（Concentration factor =1）淡水河、烏溪、急水溪與阿公店溪的LacZ unit值均低於2000，當樣本濃縮至環境濃度10倍時（Concentration factor =10），烏溪的LacZ unit值仍低於2000，而淡水河、急水溪與阿公店溪有略為提高，但仍在3000以下。北氱溪、曾文溪、東氱溪與高屏溪在環境濃度下LacZ unit值均低於1000，在10倍環境濃度時北氱溪與曾文溪其值均低於2000，東氱溪則在3000以下，高屏溪則略高出3000。 鹽水溪與二仁溪之樣本在環境濃度下LacZ unit值便接近2000，特別是鹽水溪中氲（YS3）已超過2000，該兩條溪流AhR活性已明顯高於其它河川，而樣本經濃縮為環境濃度10倍後，LacZ unit值亦有顯著的上升，特別是鹽水溪的下氲（YS5）河段，其LacZ unit已接近5000。圖中鹽水溪的中氲（YS3）與二仁溪的支流（ERN6）及上氲（ER1）在環境濃度10倍時，LacZ unit值並未增加卻明顯降低，此一現象為酵母菌死亡所致。由於該3個樣本於波長595 nm下的吸光度明顯低於空白樣本（數據並未列出），推估其中所含的某些物質經濃縮後，可能對酵母菌產生毒性而抑制酵母菌的生長，因此無法得知該3個樣本AhR誘導活性的情況。總結而言，所有河川樣本中以鹽水溪與二仁溪的AhR誘導活性最為明顯，特別是鹽水溪的中氲河段（YS3）最有

11. 可能含有高濃度的類戴奧辛物質存在，因此以下針對鹽水溪流域的樣本做進一步的樣本分離及儀器分析。可能含有高濃度的類戴奧辛物質存在，因此以下針對鹽水溪流域的樣本做進一步的樣本分離及儀器分析。 2. RP-HPLC分離樣本 鹽水溪流域中含有的類戴奧辛物質可能較其它流域高，特別是鹽水溪流域的中、下氲河段（YS3＆YS5）。為了分離出具類戴奧辛活性之環境污染物，及了解不同採樣點中其污染物質是否具有相關性，使用RP-HPLC分析鹽水溪各個地點的1000倍環境濃度樣本，並於分離之後以YCM3 AhR assay測試40個分段樣本的AhR誘導活性，其結果如圖二(a)所示，圖二(b)為活性最高的YS3之HPLC圖譜。 每個採樣點的分段樣本經YCM3 AhR assay檢測之後，出現高活性之分段樣本並未重複，因此推測於各個地點中會與AhR蛋白結合的物質屬於不同化合物。其中以YS3的16至20分鐘所收集到的分段樣本與AhR結合能力為最強，LacZ unit將近7000左右，推測於該區間內含有對AhR蛋白親和力非常高的物質。此外，將LacZ unit圖中有明顯活性誘導的時間點(圖二(a))，對應至下方的層析圖譜可發現(圖二(b))，除了25至27分鐘可對應到峰值外，在其它停留時間具有AhR活性的分段樣品，於層析圖譜上並無發現有任何明顯的對應峰值。此一現象推測有兩種可能，一是該種會與AhR蛋白具有很強親和力的物質，在分段樣本中含量極少，因此使得吸光度不夠顯著，故提高樣本的注射量可能可以改善此問題。二則是會與AhR蛋白結合的物質於偵測器的偵測範圍內不具有吸光的特性，若要改善問題，可能需使用其它非破壞性偵測器，或是嘗試與破壞性偵測器並聯共同使用。

12. 3. 使用儀器分析法找出主要誘導AhR 活性之污染物質 由上述結果可知，YS3 誘導AhR 活性之能力最強，其LacZ unit 值經標準曲線換算之後得知，於環境濃度下之類戴奧辛當量濃度高達14.9 ± 2.1 nM β-NF-equivalent，且經樣本分離後發現，於16 至20 分鐘所收集的樣品具有對AhR 蛋白結合能力非常高之化合物。 由於在層析圖譜上16 至20 分鐘時沒有明顯峰值，因此以提高注射量（100 μL）與濃度（4000 倍的環境濃度）的方式，特別再針對這段時間進行分析，其結果於16 至20 分鐘的液相層析圖譜中出現明顯的峰值，但其組成相當複雜。為從此分段樣本中找出真正會與AhR 蛋白結合的物質，針對YS3 的16 至20 分鐘分段樣本做進一步的分離。將層析管柱改為XBridgeTM Phenyl 3.5 μm column （4.6×150 mm Waters, USA），溶媒流速改為0.5 mL/min，初始溶媒組成不變，但梯度時間拉長至第40 分鐘，於第40 分鐘溶媒組成才以100%甲醇沖提直至第60 分鐘後結束，其分析結果如圖三。

13. 經改變RP-HPLC之操作條件後，由YS3之16至20分鐘樣本中成功分離出6個明顯的波峰。分別收集這6個峰值的樣本，並將這6個樣本再做一次YCM3AhR assay後發現，收集於第4個波峰的樣本具有與AhR蛋白結合的特性，因此進一步將該純化後的樣本以LC-MS/MS進行分析。初步推測該物質的母離子訊號為395.15，以3種不同電壓（10eV、15eV 與20eV）進行分析產生的碎片離子特徵峰為331，又因為操作時選用負電壓質量掃描模式，故推測該類戴奧辛物質之分子量為396.15。

14. 結論 以重組酵母菌報導基因試驗法檢測結果發現，在所有的河川水樣當中以鹽水溪與二仁溪的樣本所誘發的AhR活性遠高於其他河川樣本。於環境濃度下以鹽水溪的中氲河段（YS3）樣本之AhR誘導活性最高，類戴奧辛當量濃度為14.9 ± 2.1 nM β-NF-equivalent。以LC-MS/MS分析該純化樣本發現，該物質分子量約為396.15，但於質譜的資料庫中尚未找到相應的物質。 重組酵母菌報導基因試驗法在分析流程上，從養菌至數據呈現，僅需兩天的時間，配合微量盤及微量盤分光光度計，可在短時間內同時分析大量的樣品，對於初步調查河川中類戴奧辛物質之分佈，具有相當良好的可應用性，若能搭配完整的樣本分離技術以及儀器分析方法，將可進一步鑑定河川中的類戴奧辛物質。

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