Szilárd fázisú peptidszintézis polisztirol-divinilbenzol gyantán

1. x NH2-CHR1-CO W-NH-CHR1-CO x NH2-CHR1-CO W-NH-CHR1-CO x NH2-CHR1-CO W-NH-CHR1-CO W-NH-CHR2-CONH-CHR1-CO W-NH-CHR2-CONH-CHR1-CO W-NH-CHR2-CONH-CHR1-CO Szilárd fázisú peptidszintézispolisztirol-divinilbenzol gyantán funkcionalizálás első aminosav felkapcsolása hasítás semlegesítés W-NH-CHR2-COOH karboxilcsoport aktiválás 1,4-divinil-benzol ismétlés n-szer W-NH-CHRn-CO·····NH-CHR1-CO W-NH-CHRn-CO·····NH-CHR1-CO W-NH-CHRn-CO·····NH-CHR1-CO hasítás, tisztítás, stb.

2. Szükséges feltételek a sikeres szilárd fázisú peptidszintézishez • Hordozó polimer1. Tartalmazzon funkcionalizálható reaktív rész2. A kialakított peptid-polimer kötés hatékonyan hasítható legyen3. Stabil legyen fizikai behatásokra és a kémiai szintézis körülményei között4. A növekvő peptidlánc jó hozzáférhetősége az oldószerek és a reagensek számára • Védőcsoport kombináció1. A peptid-polimer kötés stabil legyen végig a szintézis alatt2. Átmeneti a-aminocsoport védelem3. A szintézis során stabil oldallánc védőcsoportok4. A peptid-polimerkötés és az oldallánc védőcsoportok egylépéses hatékony hasíthatósága • Reagensek1. Aktiválószerk2. Hasítóelegyek

3. híg savakra érzékeny (TFA/DCM) erős savakra hasad HF, TFMSA Szilárd fázisú peptidszintetikus stratégiák Két alapvető, széles körben használt stratégia a Boc/benzil és az Fmoc/t-butil kémián alapuló módszer. Boc/benzil stratégia Merrifield gyanta: A benzilészter típusú peptid-gyanta kötés nem elegendően stabil az ismételt savas hasításokra és részleges hasadásuk következik be. A Pam-típusúhandle savra sokkal ellenállóbb peptid-gyanta kapcsolatot eredményez. PAM-gyanta: fenilacetamidometil handle DCC néhány lépés és vagy vegyületekből kiindulva C-terminális peptidamidok előállítására más típusú szilárd hordozó szükséges MBHA-gyanta (4-metil-benzhidril-amin) savas hasítás (HF, TFMSA)

4. TFMSA + N-hidroximetil-ftálimid N2H4 aminometil-gyanta Gyantakapacitás meghatározása • Kjeldahl N meghatározás • pikrinsavas titrálás • Kjeldahl N meghatározás: • gyanta roncsolása cc. H2SO4-val, 24 óra • az oldat lúgosítása • NH3 kidesztillálása, elnyeletés vízben • titrálás 0,004M H2SO4 oldattal

5. Általánosan alkalmazott oldallánc-védőcsoportok a Boc kémiában Funkciós csoport Védőcsoport -OH (Ser, Thr) Bzl Meb Mob -SH (Cys) Acm O -S-CH3 (Met) OBzl -COOH (Asp, Glu) OcHex -NH2 (Lys) Z, ClZ

6. (Arg) Tos Mts BrZ (Tyr) For (Trp) Tos (t) (His) Dnp (t) p t Bom (p)

7. Boc-szintézis protokollja I. Peptid szekvencia: MW (védett peptid): (szabad peptid): II. Kiindulási polimer szubsztitúció (mmol/g): gyanta mennyiség (g): össz. mmol: Boc (PAM-gyanta) III. Lánchosszabbítás DCC/HOBt eljárással dátum: / / Aminosav Boc-származék MW: Negatív teszt: folytatás az A lépéstől a következő aminosav-származékkal Pozitív teszt: újrakapcsolás (ismétlés a C lépéstől)

8. O R C N H Q peptid PF6- PF6- PF6- Kapcsolási módszerek és kapcsoló reagensek DCC N-acil-urea O-acil-izourea + HOBt R-COOH H2N-Q HOBt aktívészter +DCU H2N-Q H2N-Q szimmetrikus anhidrid + DCU + DCU BOP DIPCDI HOBt HBTU BF4- HOAt OPfp TBTU PyBOP ODhbt

9. 7-aza-1-hidroxibenzotriazol (HOAt) Apoláros, nehéz szekvenciáknálm sokkal jobb eredmény, mint HBTU, TBTU, BOP AOP, HATU, TATU Z-Gly-Phe-OH + H-Pro-NH2

10. In situ semlegesítés Schnölzer M. et al.: Int J Pept Protein Res. 40, 180 (1992) • Problémák a semlegesítés és a kapcsolás alatt: • C-terminális 1 v. 2 pozícióban Pro  diketopiperazin képződés, dipeptidvesztés a gyantáról • piroglutaminsav képződés • láncletörés HBTU v. TBTU kapcsolódás útján • acetileződés (Boc-AA-k EtOAc-ból kristályosítva bomlástermékként HOAc-t tartalmaz 100% TFA hasítás 2x1 perc DMF mosás folyamatos v. többször kapcsolás, aktivált Boc-AA, DIEA 10 perc DMF mosás DIC/HOBt esetén 1,5 ekv DIEA a gyantakapacitásra számolva HBTU esetén pl. 0,2 mmol gyanta, 0,8 mmol Boc-AA-OH 0,76 mmol HBTU, 1,2 mmol DIEA A problémákat kiküszöbölték és racemizációt sem tapasztaltak!

11. Boc stratégia végső hasítási protokollja Tartalmaz-e a peptid His(Dnp) részt? igen nem Dnp eltávolítása; tiofenol-DIEA-DMF (3:3:4), 6x1óra;csak ezután TFA-hasítás Van-e Boc csoport az N-terminálison? igen nem Boc-csoport hasítása; 50% TFA-CH2Cl2, 20 perc Hasító reagens kiválasztása HF TFMSA TMSOTf 1M TMSOTf-tioanizol/TFA EDT, m-krezol 60-120perc, °C „Low-high” TFMSA Peptid Trp(CHO) részt tartalmez-e? nem igen Standard TFMSA-hasítás: TFA-TFMSA-gyökfogó (80:12:8); 30-120 perc, szobahőmérsékleten Hasítás: HF-gyökfogó (pl. 10% anizol) 1 óra, -5-0°C Trp(CHO) deformilezése piperidin-DMF (1:1) 1-2 perc, 0°C

12. Mellékreakciók az SN1 típusú hasításnál HF alkilál: Tyr, Trp, Met, Cys HF Hasításnál karbokation keletkezik, amelyet megfelelő gyökfogóval ki lehet iktatni a rendszerből. Asp  szukcinimid (a-, b-peptid) Glu  Pyr aromás amidok acilje Glu-anizol adduktum HF intramolekuláris intermolekuláris karbokation elektrofilicitási sorrend But < BrZ < cHex < 2,6-ClBzl < Bzl 0,05% 0,1% 0,5% 5,0% 20% (%: 3-alkiltirozin mennyisége)

13. pl. R = NH2-CH-CO2H Tioanizol (1M) szerepe a hasításban „pull-push” mechanizmus CF3SO3- + H2O Védőcsoporthasítási reakció TMSOTf-tioanizol/TFA eleggyel TMSOTf gyorsabb, mint TFMSA TFMSA szobahőmérséklet, a gyantáról való tökéletesebb hasításhoz BHA gyantáról nem hasítanak kielégítően m-krezol, EDT gyökfogók használata ajánlott

14. Gyökfogók (scavangers) Gyenge szerves bázisok gyökfogóként peptidek erős savas hasításánál *J: jó, K: közepes, Gy: gyenge -minél kisebb negatív érték a pKa, annál kevésbé protonálja (inaktiválja) a sav a gyökfogót -azonos típus hatékony (Met, Trp) -tiofenol típus a legjobb, de nem stabilak – gyökátvivők, más gyökfogóval együtt alkalmazva -DTT (Cleland-reagens) 1,4-dimerkapto-2,3-butándiol szilárd, nem büdös, kissé polimerizál -javaslat: 10 ml HF : 1 g p-krezol: 0,1 g DTT

15. „Low-High” HF hasítás Tam J.P. et al.: Int. J. Pept. Prot. Res., 20, 57 (1383) • 0,2 mmol peptid-gyanta 1 ml p-krezol, 6,5 ml DMS ( Trp(For) : 0,75 p-krezol 0,25 p-tiokrezol) • 2,5 ml HF • 2-3 óra 0°C-on hasítás • HF, DMS elszívatás (igen hosszadalmas lehet) • 10 ml HF (friss scavanger) • 45 perc 0°c-on hasítás • HF elpárologtatás HF-DMS-p-krezol (25:65:10 v/v), 0°C, 3 óra low HF: Met(O)  Met Trp(For)  Trp nem képződik közben karbokation low HF SN2 típusú reakció high HF SN1 típusú reakció low TFMSA: 15% TFMSA, 30% DMS, 55% TFA

16. Fmoc/t-butil stratégia hasítás bázissal (piperidin/DMF) TFA-ra hasad Szerves szekunder aminok: Piperidin, morfolin, dietilamin DBU, TBAF A para-alkoxi szubsztituens csökkenti a peptid-gyanta kötés savval szembeni stabilitását A piperidinnel kiváltott Fmoc hasítás mechanizmusa + CO2 + piperidin dibenzofulvén-piperidin addukt erős UV-elnyelést mutat 304 nm-nél, ami alkalmas a detektálásra Számos lehetőséget dolgoztak ki a peptid-gyanta közötti kapcsolat kialakítására, amelyek segítségével szabad karboxil vagy amid C-terminálisú peptidekhez, illetve védett peptidfragmensekhez juthatunk:

17. Szerkezet Hasítás Keletkező C-terminális TFA COOH p-alkoxi-benzil (Wang) gyanta TFA COOH 3-(4-hidroximetil-fenoxi)propionsav handle [Albericio & Barany, IJJPR, 23, 342 (1984)] TFA CONH2 4-(4’-metoxi-benzhidril)fenoxi-ecetsav handle [Breipohl et al., TL 28, 5651 (1987)] TFA CONH2 5-(4-aminometil-3,5-dimetoxi-fenoxi)-valeriánsav handle [Albericio & Barany, IJJPR 30, 206 (1987)] 1% TFA – CH2Cl2 COOH 4-(4’-hidroximetil-3-metoxi-fenoxi)-butánsav handle [Flörsheimer & Riniker, Peptides 1990, 131 (1990)]

18. Szerkezet Hasítás Keletkező C-terminális Pd0 COOH hidroxikrotonil-aminometil gyanta (HYCRAM® gyanta) [Kunz et al., Peptides 1988, pp. 154-156] AcOH COOH 2-klór-tritil gyanta [Barlos et al., TL, 30, 3947 (1989)] AcOH, híg TFA CONH2 4-(2’,4’-dimetoxi-fenil-aminometil)-fenoxi gyanta [Rink, TL, 28, 3787 (1987)] AcOH, híg TFA CONH2 4-(2’,4’-dimetoxi-fenil-aminometil)-fenol handle [Rink, TL, 28, 3787 (1987)]

19. Általánosan alkalmazott oldallánc-védőcsoportok az Fmoc kémiában Funkciós csoport Védőcsoport -OH (Ser, Thr) tBu -SH (Cys) (Tyr) OtBu -COOH (Asp, Glu) -NH2 (Lys) Boc -SH (Cys) Trt

20. O CH2 N N Mtr Pmc (Arg) Adoc2 Boc (t) Bom (p) p t (His) Trt (t)

21. Fmoc-szintézis protokollja I. Peptid szekvencia: MW (védett peptid): (szabad peptid): II. Kiindulási polimer szubsztitúció (mmol/g): gyanta mennyiség (g): össz. mmol: Fmoc -OCH2-F- OCH2-F-R (Wang-gyanta) III. Lánchosszabbítás DIC/HOBt eljárással dátum: / / Aminosav Fmoc-származék MW: Negatív teszt: folytatás az A lépéstől a következő aminosav-származékkal Pozitív teszt: újrakapcsolás (ismétlés a C lépéstől)

22. Fmoc stratégia végső hasítási protokollja Tartalmaz-e a peptid Fmoc csoportot az N-terminálison? igen nem Fmoc csoport hasítása; 20% piperidin/DMF 30 perc; szobahőmérséklet Tartalmaz-e a peptid Arg, Met, Trp aminosavakat vagy Trt védőcsoportot? nem igen Arg, Met tartalom a peptidben Hasítóelegy A: 95% TFA, 5% gyökfogó* nem nem igen Trp vagy Trt védőcsoportot tartalmaz-e a peptid? Hasítóelegy B: 10 ml TFA 0,25 ml EDT 0,5 ml tioanizol 0,5 ml H2O 0,75 g fenol igen Hasítóelegy C: 95% TFA, 2,5% EDT, 2,5% H2O *H2O, anizol, stb.

23. Ciklopeptidek kialakítása gyantán OcHex Bzl OcHex MBHA Bzl Boc-SALLEDPVG- MBHA Boc-SALLEDPVG- OFm OBzl 0,2M TBAF/DMF (20 perc) • 33% TFA/DCM (2+20 perc) • 1M TMSOTf-tioanizol/TFA(30 perc, 0°C) • 10% DIEA/DCM (3x1 perc) OcHex Bzl MBHA Boc-SALLEDPVG- • 40% TFA/DCM (1+20 perc) • 5% DIEA/DCM (3x1 perc) OcHex OcHex Bzl BHA H-SALLEDPVG- MBHA H-SALLEDPVG- BOP (6 ekv), DIEA (12 ekv)/DMF BOP (6 ekv), DIEA (12 ekv)/DMF 1 éjszaka OcHex Bzl OcHex MBHA SALLEDPVG- BHA SALLEDPVG- HF-anizol (9:1) (1 óra, 0°C) HF-p-krezol-DTT (10:1:0,1) (1 óra, 0°C) SALLEDPVG-NH2 SALLEDPVG-NH2

24. Diszulfidhíd kialakítása polimer hordozón SAcm SAcm SMeb SMeb 1 1 2 7 R Fmoc PAL 7 10 Boc R PAM 3 13 13 18 21 STmob STmob SFm SFm piperidin-DMF (1:1) 25°C, 3 óra • Fmoc hasítás • TFA-DCM-Et3SiH-H2O(7:92:0,5:0,5) SMeb SMeb SAcm SAcm Boc R PAM R H PAL S S SH SH HF–p-krezol (9:1) 0°C, 1 óra 0,02M CCl4-Et3N/NMP 20°C, 4 óra SAcm SAcm SH SH R H OH PAL H S S S S levegő oxidáció pH=8,0 25°C, 36 óra Tl(tfa)3 (2ekv)/DMF-anizol (19:1) 4°C, 18 óra S S S S R H PAL OH H S S S S TFA-DCM-Et3SiH-H2O(95:4:0,5:0,5) 25°C, 2 óra PAL: trisz(alkoxi)benzilamid linker 5-(4-Fmoc-)aminometil-3,5- dimetoxi-fenoxi-valeriánsav Tmob: 2,4,6-trimetoxi-benzil Tl(tfa)3: tallium(III)-trifluor-acetát NMP: N-metil-pirrolidon S S NH2 H S S