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实验 四 目的基因的表达及表达产物的初步提取. 一 实验原理. 要使目的基因的表达量达到一定规模，除了在细菌培养的数量上要扩大之外，还要严格控制最优化表达条件，特别是控制培养温度。 在诱导剂的诱导下，培养物在 37℃ 情况下培养时，表达的目的蛋白以包涵体的形式存在，大量聚积在宿主细胞的细胞质内，而当培养物在 20℃ 情况下培养时，目的蛋白则以可溶状态出现。. 一 实验原理.
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实验 四 目的基因的表达及表达产物的初步提取
一 实验原理 • 要使目的基因的表达量达到一定规模，除了在细菌培养的数量上要扩大之外，还要严格控制最优化表达条件，特别是控制培养温度。 • 在诱导剂的诱导下，培养物在37℃情况下培养时，表达的目的蛋白以包涵体的形式存在，大量聚积在宿主细胞的细胞质内，而当培养物在20℃情况下培养时，目的蛋白则以可溶状态出现。
一 实验原理 • 蛋白质在大肠杆菌中高水平的表达，常常导致产生细胞质颗粒，这些颗粒以包涵体形式存在，能通过相差显微镜观察到，并能通过离心的方法将其从细胞裂解物中分离出来，通过Triton X-100和EDTA或低浓度尿素的作用，即可获得较纯净的包涵体，用8M尿素或6M盐酸胍可以使包涵体溶解。而BL21（DE3）.pGEX-6p细菌在20℃被乳糖诱导时，产生可溶性的GST。
二实验试剂 • 溶霉菌 （10mg/ml溶于10mM Tris Cl pH8.0） • Triton-100 • 0.5M/L 尿素 • 8M/L 尿素 • 裂解液： • 50ml Tris Cl （pH8.0） • 1mM EDTA • 100mM NaCl • 含1mM ENTA的PBS • PBS： NaCl 8g， KCl0.2g， Na2HPO41.44g， KH2PO4 0.24g加双蒸水800ml，用HCl调pH到7.4，再加水到1000ml，分装后，15磅20分钟灭菌。 • 100mM PMSF 母液：17.4mg/ml溶于异丙醇，-20℃保存。
三 操作步骤 • 1诱导表达 • 将一BL21（DE3）pGEX-6p的单菌落接种于50ml含Amp（100µg/ml）的LB液体培养基中，37℃，250rmp振荡培养过夜。分别取10ml转种于150ml含Amp（100µg/ml）LB液体培养基中， 37℃，250rpm继续培养，直至OD600值为1.0，加入10%乳糖至终浓度为1%，从各自加乳糖诱导开始计时，在20℃，250rpm振荡培养16小时。各取1ml菌液经煮沸理裂解后进行12%SDS-PAGE检测，将剩余的培养物离心收集菌体。
三 操作步骤 • 2可溶性目的蛋白的提纯： • 将经20℃诱导表达的BL21（DE3）pGEX-6p菌液小心转入离心管中，4 ，000rpm离心收集菌体，按3ml/g（湿重）加入含1mM EDTA 的PBS，加入8µl 50mM PMSF悬浮液。加入80µl溶霉菌（10mg/ml）作用30分钟，超声波处理菌悬液，每间隔1分钟超声波处理30秒，反复进行，直至细菌裂解。在4℃下，13，000rpm离心15分钟，上清即为含有目的蛋白的粗提液。取100µl粗提液进行12%SDS-PAGE凝胶电泳检测。将此粗提液经过盐析、脱盐、离子交换层析，凝胶柱层析纯化，即可获得目的蛋白纯化产品，最后的纯化实验将在以后进行。
四 思考题 • 请思考溶菌酶和超声波处理在细菌细胞裂解过程的作用有何不同？
