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Evgeniy Zavoisky. 1944 Universidad estatal de Kazan, Rusia Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR). CuCl 2 ·2H 2 O. Premios Nobel y resonancia.
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EvgeniyZavoisky 1944 Universidad estatal de Kazan, Rusia Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR) CuCl2·2H2O
Premios Nobel y resonancia • Física 1952 - for their development of new methods for nuclear magnetic precision measurements and discoveries in connection therewith - Felix Bloch y Edward Mills Purcell • Química 1991 - for his contributions to the development of the methodology of high resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy - Richard R. Ernst. • Química 2002 - for his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution - Kurt Wüthrich • Fisiología o Medicina 2003 - for their discoveries concerning magnetic resonance imaging - Paul C. Lauterbur y Sir Peter Mansfield
Resonancia paramagnética electrónica (EPR) • ¿Qué se detecta? • Moléculas con uno o más electrones desapareados • ¿En qué se basa? - Los electrones desapareados tienen momento magnético de spin - El spin electrónico tiene dos números cuánticos que tienen la misma energía en ausencia de campo magnético • Cuando se exponen a un campo magnético se generan dos estados energéticos y por lo tanto una transición Meth. Enz.246: 536
El experimento Energía ms= - ½ Absorción h Campo magnético (B) ms= ½ Primera derivada Señal de EPR Bo Campo magnético (B) Bo Campo magnético (B)
El espectro de EPR E = h = g Bo β g = cociente giromagnético (2.0023 para un electrón libre) β = Magnetón de Bohr (momento angular del electrón; 9.2741 x 10-24 JT-1) Bo = Campo magnético aplicado ~ 9.75 GHz para la banda X
Desdoblamiento hiperfino • El campo magnético experimentado por el electrón desapareado se ve afectado por los núcleos cercanos que tengan spin nuclear Spin nuclear: 1H I = ½ 2H I = 1 12C I = 0 13C I = ½ 14N I = 1 15N I = ½ Estados energéticos: I = ½: + ½, -½ I = 1: -1, 0, 1 Núm. de líneas = 2n (I + ½) n = núcleos equivalentes
Desdoblamiento hiperfino I = 1 : 14N 1 0 -1 ms mI E 1 0 -1 ½ h -1 0 1 aN aN Desdoblamiento hiperfino -1 0 1 - ½ Campo magnético
Desdoblamiento hiperfino Sin desdoblamiento 1 núcleo I=1/2 (1H) 1 núcleo I=1 (14N) 2 núcleos idénticos I=1/2 1 núcleo I=5/2 (17O) 10 Gauss
El desdoblamiento hiperfino es aditivo aN aN 4-POBN-CH(CH3)OH aH aH aH Campo magnético
Consideraciones acerca de líneas e intensidades • (2 I + 1) líneas por cada núcleo • (2 I1 + 1) (2 I2 +1) …. para más de un núcleo • (2 nI + 1) en el caso de n núcleos equivalentes • El espectro debe ser simétrico con respecto al centro. Si no… • - Más de un radical con valores diferentes de g • - Tiempo de correlación lento • No hay una línea central intensa: número impar de núcleos equivalentes con I = ½
Señales de EPR de iones metálicos de transición • Varían mucho según: • i) el ion metálico • ii) el estado de oxidación • iii) el estado de spin • iv) los ligandos • v) el número de iones metálicos asociados • Depende mucho de interacciones spin-orbital e interacciones spin-spin cuando hay más de un electrón desapareado • A veces necesitan temperaturas bajas para ser detectables (N2 o He líquidos) • Dependen mucho de la simetría alrededor del ion metálico • Observables en iones metálicos con spines semienteros (S = ½, 3⁄2, 5⁄2) pero no en ionescon spines enteros(S =1, 2)
Configuración electrónica de algunos iones metálicos de transición Fe3+, Mn2+ S = 5/2, (alto spin) 3d5 S = 1/2, (bajo spin) Fe2+ S = 2, (alto spin) 3d6 S = 0, (bajo spin) S = 1/2 Cu2+ 3d9 Cu+ S = 0 3d10
Galactosa oxidasa JBC (1988) 263: 6074 Biochemistry (2009) 47:6637
¿Quién está interesado en EPR para bioquímica? • Áreas relacionadas con estrés oxidativo y antioxidantes • Áreas relacionadas con catálisis enzimática que involucra radicales • Áreas relacionadas con metaloproteínas no enzimáticas
Coenzima o cofactor Enzima Chem. Rev. (2006) 106: 3302
Radicales de aminoácidos en catálisis enzimática Ribonucleótido reductasa (RNR) clase I Fotosistema II YD· YZ· Prostaglandina H sintasa
Radicales de aminoácidos en catálisis enzimática citocromo peroxidasa RNR clase II RNR clase III piruvato formiato liasa
Metaloproteínas no enzimáticas g ~ 2.07 g ~ 2.08 Sangre venosa Sangre arterial Ax = 17 G g ~ 2.02 80 G Az = 17 G g ~ 1.98 80 G g ~ 2.00 g ~ 1.98 Detección de nitrosil Hb en sangre de ratas tratadas con LPS Kosaka et al., AJP 1994
Espectros de EPR de plasma Plasma Plasma + 0.5 mM ONOO- Vasquez-Vivar et al, Biochem. J, 1996
EPR con flujo continuo Detección de radical carbonato 35% CO3.-+ .NO2 ONOO- + CO2 65% CO2 + NO3- HCO3-/CO2 ONOO- Celda de mezcla 9 mm/ 5 ms Campo magnético
Detección de radical carbonato ONOO- HCO3-/CO2 ONOO- H13CO3-/13CO2 ONOO- + CO2 CO3.-+ .NO2 65% CO2 + NO3- Bonini et al. , JBC 1999
Detección de radical cromanilo Botti et al. , Chem. Res. Toxicol. 2004
Detección de radical cromanilo Botti et al. , Chem. Res. Toxicol. 2004
EPR directo con muestras congeladas • Aplicable a radicales de vida corta y metales de transición • 77 K (nitrógeno líquido) o 4 K (helio líquido) • Uso limitado debido a la anisotropía
SPIN TRAPPING ST + R.SA. aducto de spin (paramagnético) spin trap (diamagnético) radical transitorio • Gran aplicación pero brinda información estructural muy limitada • Hay dos clases principales de ST: nitronas y nitrosos
Spin traps de nitrona C ( C H ) 3 3 • DMPO (5,5-dimetilpirrolina N-óxido) M e M e R R. + H M e M e N N H . - O O • PBN (fenil-N-t-butilnitrona) R + . R C C C N ( H ) C N 3 3 - H O . O H + Reaccionan con gran variedad de radicales(-RC., RO., RS.) + Los aductos son a menudo muy estables + No son demasiado tóxicos - La asignación estructural es difícil porque los espectros son similares
Spin traps de compuestos nitroso . N O C ( C H ) 3 3 R B r • MNP (2-metil-2-nitrosopropano) . R C ( C H ) O N 3 3 • DBNBS (3,5-dibromo-4-nitrosobencensulfonato) B r . . R - - N O N S O S O O 3 3 R B r B r + Brindan una identificaciónmás fácil del radical - Aductos térmicamente inestables y sensibles a la luz - Forman dímeros inertes - Poco confiables para radicales centrados en oxígeno
Spin trapping con proteínas 20 G 20 G 2 G Espectros de la reacción de HbO2 con peroxinitrito en presencia de MNP: Formación de radicales en la proteína . N O C ( C H ) 3 3 1 mM HbO2 1 mM ONOO- 20 mM MNP R MNP + Pronasa acoplamiento superhiperfino Romero et al., JBC 2003