第四章 电离辐射的细胞效应

1. 第四章电离辐射的细胞效应

2. 第一节细胞的放射敏感性

3. 衡量辐射敏感性的指标 • 个体，常用存活率或半致死剂量 • 细胞，多数情况下都用克隆形成率(成灶率)表示其存活率，对肿瘤细胞也用SF2(2Gy照射后的存活率)；此外，染色体畸变率也是常用的评价指标。

4. 一、哺乳动物细胞辐射敏感性的差异 • 1、不同细胞群体的放射敏感性 • 体内细胞群体依据更新速率分为： • （1）不断分裂更新的细胞群体→敏感 • （2）不分裂的细胞群体→抗性 • （3）一般状态不分裂或分裂很慢→抗性；但刺激后迅速分裂→敏感。

5. 第一类细胞：造血淋巴组织细胞，胃肠粘膜上皮和生殖上皮细胞第一类细胞：造血淋巴组织细胞，胃肠粘膜上皮和生殖上皮细胞 • 第二类细胞：神经元，肌纤维，成熟粒细胞，红细胞等。 • 第三类细胞：刺激后活跃分裂的，如再生肝

6. Bergonie&Tribondeau定律： 组织的放射敏感性与其细胞的分裂活动成正比而与其分化程度成反比。 • 一般适合 • 有许多例外 • 如胸腺、淋巴细胞

7. 肿瘤细胞的辐射敏感性 • 敏感性有明显差异 对射线高度敏感的肿瘤有：恶性淋巴瘤、精原细胞瘤、肾母细胞瘤等； 中度敏感的，如多种鳞状上皮癌、分化差的腺癌、脑胶质瘤等； 对放射治疗表现抗性的如恶性黑素瘤、胃癌、软骨肉瘤等

8. 二、不同细胞周期时相的放射敏感性

10. G1 →细胞间期 • S →DNA合成期 • G2→细胞间期 • M→细胞分裂期 • 对辐射的敏感性： M >G2 > G1>S早>S晚

12. 慢性低剂量照射 • 细胞更新系统的再生反应取决于体内许多因素 • 细胞本身的因素有： • 1）细胞新生速率 • 2）细胞丢失速率 • 3）细胞周期时间

13. 三、环境因素对细胞放射敏感性的影响 细胞所处环境影响: • 氧分压 • 防护和增敏作用的化学因子 • 密集抑制的稳相细胞培养：细胞处于拥挤状态，其生长、增殖受抑，放射敏感性降低 • 潜在致死性损伤（potential lethal damage ,PLD)照射后，使细胞处于次佳生长环境下，染色体已受损的细胞若不立即进入分裂期，有丝分裂的延迟有利于DNA的修复。

14. 四、细胞放射敏感性的机制探讨 • 几种机制 1）DNA双链断裂的修复 （1）DNA SSB的修复与细胞的SLD修复有关 （2）DNA DSB的修复与PLD修复有关 2）染色质结构的影响 S期为染色质；G2/M期为染色体 3）初始DNA断裂 酶学修复过程之前的损伤产额

15. 凡是有双链重接缺陷的细胞，其敏感性都是高的；然而敏感性高的细胞却不一定有明显的重接修复异常。原因有：（1）修复效率变化的幅度较小，现有的测定方法不够灵敏，不能测知。（2）重接速率虽无变化，但修复不正确。如AT。（3）各时相细胞内天然存在的SH化合物水平不同，G2/M<S。（4）存在别的机理。凡是有双链重接缺陷的细胞，其敏感性都是高的；然而敏感性高的细胞却不一定有明显的重接修复异常。原因有：（1）修复效率变化的幅度较小，现有的测定方法不够灵敏，不能测知。（2）重接速率虽无变化，但修复不正确。如AT。（3）各时相细胞内天然存在的SH化合物水平不同，G2/M<S。（4）存在别的机理。

16. 第二节 电离辐射对细胞周期过程的影响 检查点（check points) • 细胞周期进程中向各个时相过渡的点

17. 一、细胞周期的运行原理 • 1、周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶 • 1)G1 cyclins和CDKs • G1期周期蛋白是指G1期或G1／S交界处发挥作用、启动细胞周期和促进DNA合成的周期蛋白。目前已发现周期蛋白C、周期蛋白D、周期蛋白E等多种。

18. 周期蛋白c主要在果蝇及人的细胞中发现； • 周期蛋白D则主要存在于鼠类及人的细胞，它在休止细胞中不表达，经生长因子刺激后表达增加；周期蛋白D的表达水平在细胞周期任何时点都不锐减，其合成和活性在GI后期亦仅达一较低峰值；周期蛋白D活性依赖细胞内生长因子的存在，除去生长因子则周期蛋白D水平即刻降低，周期蛋白D与cDK4／CDK6形成复合物，调节G1期进展；

19. 周期蛋白E是人类的GI周期蛋白，其mRNA和蛋白质水平在G1／s交界处急剧升高达峰值，进入s期后降解，周期蛋白E—CDK2复合物调节细胞周期进入S期，并在人类细胞的DNA合成启动中起重要作用。周期蛋白E是人类的GI周期蛋白，其mRNA和蛋白质水平在G1／s交界处急剧升高达峰值，进入s期后降解，周期蛋白E—CDK2复合物调节细胞周期进入S期，并在人类细胞的DNA合成启动中起重要作用。

21. 2、M期周期蛋白和CDKs • M-周期蛋白是指在G2／M期转换时发挥作用、诱导细胞分裂的一类周期蛋白。包括周期蛋白A和周期蛋白B。 • 周期蛋白A主要在S期发挥作用，它合成始于G1后期、进入S期后形成周期蛋白A—CDK2复合物，调节S期进展。

22. 周期蛋白B表达水平至G2期达峰值，周期蛋白B－CDC(cell division cycle gene)复合物调节细胞周期进人M期 • 周期蛋白A在S期发挥作用，与DNA复制的完成有关；周期蛋白B在G2／M交界处发挥作用，诱发细胞分裂.

23. 2 、周期蛋白依赖性激酶活性的调控 • 1）CDK的激活 • CDK的活性依赖于与周期蛋白的结合和保守苏氨酸残基的磷酸化，CDK活性受周期蛋白结合以及特定保守苏氨酸残基磷酸化的调节。 • 2）CDK抑制 • CDK—周期蛋白复合体中周期蛋白的解离和磷酸化激活位点Thr的去磷酸使CDK处于失活状态．因而，在细胞周期中使周期蛋白水平下降与激活位点Thr去磷酸的有关因素也是CDK抑制调控的重要因素。

24. 二、几个参与细胞周期调控的重要基因 • 三条相互联系的细胞周期调节系统： • (1)Ras介导的MAPK信号转导系统； • (2)CIP1／KIP1家族介导P53→P2lWAF1/CIP1→周期蛋白E／CDK2，周期蛋白D／CDK4→pRB途径： • (3)INK4家族介导的P16INK4a→周期蛋白D／CDK4一pRB途径。

25. 1、pRB（nuclear phosphoprotein） • pRB作为细胞周期和基因转录调控的枢纽，通过调整E2F等转录因子的功能在细胞增殖和分化的控制中发挥关键作用。 在某一给定细胞中pRB水平相对恒定，而其磷酸化/去磷酸化状态则随着细胞周期的进展而变化：在G1早期，pRB主要以脱磷酸化的活性形式存在， pRB的磷酸化主要发生在G1中期，到S期和G2／M期则主要以高度磷酸化形式存在。

26. G1期pRB磷酸化主要由周期蛋白D－CDK4／CDK6复合物催化完成。 pRB的去磷酸化在M及s期由蛋白磷酸酶1催化进行。在周期蛋白－CDK复合物与蛋白磷酸酶1的协同作用下，pRB的磷酸化／去磷酸化之间的动态平衡有效控制着G1限制点的“开启和关闭”，从而保证细胞周期的有序运行及细胞的正常增殖。

27. G1/S调控点以pRb为中心构成一个复杂网络,其共同的模式是:G1/S调控点以pRb为中心构成一个复杂网络,其共同的模式是: • 生长因子与相应受体结合,通过信号传递促进cyclin基因表达；cyclin与相应的CDK结合为激酶复合物对pRb进行磷酸化；磷酸化的pRb释放其结合并抑制的蛋白,主要是转录因子E2F以及具激酶活性的CAB-1蛋白等；游离的E2F进入核内,与多种具特殊序列的基因启动子区结合(如c-myc、b-myb、cdc2、二氢叶酸还原酶、TK及E2F-1基因等),促进这些基因的表达；这些基因的产物促进细胞通过G1/S调控点.CKI通过抑制cyclin-CDK激酶活性,使pRb不能磷酸化,pRb仍与E2F结合,E2F则不能进入核内发挥转录作用,使细胞停滞于G1期.

29. 2、p21WAF1/CIP1 p21基因定位于第六号染色体短臂上(6p21.2），P21蛋白定位于细胞核中，属CKI分子（CDK抑制分子），能广泛抑制各种周期蛋白－CDK复合物。 野生型P53蛋白作为转录因子可诱导p21WAF1/CIP1基因的表达，抑制CDK2和CDK4对pRB蛋白的磷酸化失活，进而导致G1、G1/S和S期延迟，使DNA损伤有时间得以修复。

30. 3、 P16INK4a • P16INK4a基因位于人类染色体9p21区,编码由148个氨基酸组成的分子量为16kD蛋白质。 P16INK4a与周期蛋白D1竞争性结合G1期激酶CDK4／CDK6，抑制其对pRB的磷酸化作用，使游离的E2F-1与未磷酸化的PRB结合，依赖于E2F-1转录的基因不能转录， P16INK4a间接抑制包括DNA合成在内的多种生化反应，使细胞周期正常运行。

31. 4、Ras Ras蛋白介导的MAPK信号转导途径是具有酪氨酸激酶活性的大多数生长因子及其受体传递信息的主要通路，是细胞周期正常运行的信号指令系统之一、主要由Ras蛋白→ Ras转换因子(如Raf－1)→丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等部分组成。与丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化有关。

32. 二、细胞周期进程的调控 • 三个检查点，G1→S,S→G2,G2→M • 调控因素：周期素及其相应蛋白激酶、p53和p105Rb等抑癌基因及其基因表达的蛋白 • 周期素（cyclins)家族：A,B,C,D,E,G等

34. G2→M检查点调节机制 • 有丝分裂促进因子（mitosis promoting factor,MPF）：周期素B ＋P34cdc2(cdc2基因编码的34000的磷蛋白，简称p34,具激酶活性）

38. 激活 ↓ 三、电离辐射影响细胞周期进程的机制 • 1、G2阻滞（G2 arrest) 机制：细胞由G2期进入M期受MPF调控 Cyclin B MPF 激酶P34cdc2←Thr161磷酸化、Thr14,Tyr15脱磷酸化 CyclinB的mRNA和蛋白水平下调 P34磷酸化发生变化 IR

39. 2、G1阻滞（G1 arrest） • 取决于细胞系的P53状态：只有表达野生P53的细胞，受照后才发生G1期阻滞。 • P53是作为转录因子，通过与其下游效应分子基因的靶序列结合从而激活这些基因转录的。再通过这些下游效应分子发挥调控G1期进程。

40. 2、G1阻滞（G1 arrest） 1）p53、P21及Gadd45在G1阻滞中的作用 • P53有多种下游效应分子：如MDM2，P21WAFl，Gadd45，Bax,IGFBP3，Fas等。 • MDM2通过与P53蛋白氨基末端结合来阻止P53蛋白转录激活，形成一个“负反馈环”。因此认为MDM2的正常功能是限制GI期阻滞的时间，使DNA损伤修复后的细胞重新进入细胞周期。

41. 2、G1阻滞（G1 arrest） • Gadd45和P21WAFl是参与辐射所致细胞G1期阻滞的重要分子。 • P53／P21wAF1通路是通过CDK／周期蛋白活性抑制，Rb脱磷酸化而发挥作用的。 • Gadd（growth arrest and DNA damage）是一些生长抑制和DNA损伤诱导的基因，Gadd45是其中一员，也是野生型P53诱导G1期阻滞的一条通路。

42. 2、G1阻滞（G1 arrest） 2)ATM基因在细胞周期检查点调控中的作用 • AT：毛细血管扩张性共济失调症 • ATM基因是AT唯一致病基因； • 对AT纯合子突变细胞的研究表明，这类突变细胞缺乏细胞周期检查点调控对辐射损伤的正常反应，缺乏辐射诱导P53蛋白增加、p21wAFl和Gadd45转录和翻译水平增强的动态变化，表明ATM很可能是DNA损伤反应途径中p53的上游分子。

44. 3、S相延迟（S phase delay） • 与DNA合成速率下降有关 • IR对DNA合成的抑制呈现双相的剂量－效应关系：较低剂量范围内剂量－效应曲线斜率较大（辐射敏感），较高剂量，斜率变小（辐射抗性） • 与cyclin A及P53的表达有关

45. 4、巨细胞形成 • 巨细胞：IR引起某些细胞体积增大，成为巨细胞（giant cell);内载几套染色体而不分裂； • 细胞可以存活一定时间，具有功能活性，但最总凋亡； • 可能与少数细胞P21缺失或其上游调控者P53基因表达有关。

46. 四、电离辐射影响细胞周期进程的生物学意义 • 1、机体对外界刺激的一种保护性反应，目的在于保证基因组的遗传稳定性 • 2、研究进程影响规律有利于设计合理的肿瘤治疗方案，提高化疗和放疗疗效

47. 第三节 电离辐射引起细胞死亡及其机制

48. 一、辐射引起细胞死亡的类型 • 1、增殖死亡（proliferative death) • 又名代谢死亡或延缓死亡 • 是指受照细胞丧失了持续增殖的能力、在经过一个或几个有丝分裂周期后丧失代谢活动和细胞功能而死亡。

49. 2、间期死亡（Interphase death） • 指受照射细胞未经分裂就死亡。 • 通常测定增殖死亡采用体外细胞成集落培养法，即观察单个细胞在培养条件下经多次分裂后形成一个克隆的能力。如果细胞在一次或数次分裂后不能形成一个克隆，即计为死亡；能够生长成克隆者则计为存活。而对间期死亡辨认最常用的是染料排斥法．即采用伊红、台盼蓝或氨基黑等染料染色，活细胞不着色，死细胞可被染色。 • 照射剂量很大（100Gy以上）

50. 二、细胞凋亡（apoptosis） • 概念 • 维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序死亡。 • 细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程 。 • 它包括生理性的程序死亡