Neurochemie:

1. Neurochemie: Neuropřenašeče: excitační a inhibiční aminokyseliny (glutamát, glycin, GABA) 3. přednáška

2. Aminokyseliny (AA) = základní stavební bloky proteinů • účastní se intermediátního metabolismu, v buňkách jsou vysoce koncentrovány • Je nějaká aminokyselina (AA) neuropřenašeč? Přinejmenším tyto 4 ano: jde o excitační aminokyseliny glutamát a aspartát a inhibiční neuropřenašeče kyselinu g-aminomáselnou (GABA) a glycin. I. Excitační AA ... využívá téměř každý informační neuronální okruh, podílejí se na utváření normálních synaptických kontaktů a jsou zapojeny i do takových patofyziologických procesů, jakými jsou např. epilepsie, ischemie, poškození mozku, úzkostné stavy či závislosti. Glutamát • hlavní excitační přenašeč CNS účastní se rychlého excitačního synaptického přenosu enzymy syntézy i degradace glutamátu jsou přítomny v neuronech i gliích, stejně jako vysokoafinitní transportéry aminokyselin glutamát i aspartát = neesenciální AA neprocházející hematoencefalickou bariérou syntetizovány z glukosy a dalších prekurzorů  po výlevu je glutamát primárně vychytáván gliemi, ve kterých je konvertován glutaminsynthetasou na glutamin vzniklý glutamin je transportován Na+ a H+-dependentní pumpou N-1 (SN1) homologní vesikulárnímu GABA transportéru (VGAT) glutamin je vychytáván glutamátergním nervovým zakončením, konvertován glutaminasou zpět na glutamát a použit k dalšímu výlevu

3. Výlev a zpětné vychytávání glutamátu • synaptické váčky aktivně akumulují glutamát spolu s ionty Mg2+ koncentrace glutamátu ve váčku může dosáhnout až 20 mM plnění: vesikulární glutamátový transportér (VGluT) s vysokou afinitou pro glutamát a signifikantně nižší pro aspartát po výlevu rychle zpětně vychytáván, což zajišťují přinejmenším dvě rodiny glutamátových transportérů • transport glutamátu zpět do zakončení je elektrogenní využívá elektrochemického gradientu Na+, H+ a K+ (přenos glutamátu a aspartátu i proti jejich gradientu koncentračnímu) transportéry velmi rychle schopny snížit hladinu glutamátu v synaptické štěrbině na submikromolární koncentraci vychytávají glutamát i aspartát se stejnou afinitou a zhruba stejnou rychlostí, mohou transportovat i D-aspartát, ale nikoliv D-glutamát transport je elektrogenní: s každou molekulou glutamátu je přenesen jeden proton a tři ionty sodíku do buňky a zároveň jeden ion draslíku ven • V materiálu z potkanů a mloků byly vyklonováni čtyři zástupci této vysoceafinitní rodiny glutamátových transportérů: • GLAST (glutamate-aspartate transporter)•GLT-1 (glutamate transporter-1)•EAAC (excitatory amino acid carrier-1) a•sEAAT5 (salamander excitatory amino acid transporter-5)

4. Lidskými homology jsou EAAT1, EAAT2, EAAT3 a EAAT5; EAAT4 byl naklonován v lidském motorickém kortexu. Vychytávání glutamátu v CNS se predominantně účastní GLAST a GLT-1. Excitotoxicita (ischémie): akumulace glu/aspv synaptické štěrbině  masivní aktivace glutamátových receptorů  stimulační ligandy glutamátových transportérů? Bohužel, k dispozici jsou pouze inhibitory, např.: THA(D,L-threo-3-hydorxyaspartát, širokospektrý antagonista glutamátového a aspartátového transportu) či DHK (dihydrokainát, selektivní inhibitor gliálního GLT-1).

5. Glutamátové receptory Dvě veliké rodiny: receptory ionotropní (formují iontový kanál) a receptory metabotropní (spřažené s G-proteiny). Ionotropní receptory zahrnují tyto třídy zástupců, pojmenované podle ligandů, které kromě glutamátu také váží: • NMDA receptory (N-methyl-D-aspartát, analog glutamátu) • AMPA (Q) receptory (a-amino-3-hydroxy-5-methyl-isoxazol-4-propionová kyselina) • KA receptory (kainátové receptory, kyselina kainová) • pentamery složené z různých podjednotek AMPA a NMDA receptory na synapsích kolokalizovány, ale jejich vzájemný poměr je velmi variabilní: existují i synapse „osázené“ výhradně jen AMPA či jen NMDA receptory kódovány nejméně 16 geny uvnitř každé receptorové rodiny (AMPA, NMDA, KA Rs) panuje až 80% homologie, mezi jednotlivými rodina pak homologie zhruba 50% • Po vazbě glutamátu na AMPA a/nebo NMDA receptor lze pozorovat smíšený excitační postsynaptický proud. Je dvousložkový: • první, rychlejší složka s vyšší amplitudou je nesena AMPA receptory • druhá (pomalejší a s nižší amplitudou pak NMDA receptory

6. Doba poklesu proudové odpovědi navozené NMDA receptorem může být až 100krát delší než doba samotného otevření kanálu. Proč se odpovědi AMPA a NMDA Rs liší? NMDA Rs mají vyšší afinitou ke glutamátu (Kd = 3-8 nM), takže ten z NMDA receptoru disociuje podstatně pomaleji než v případě AMPA R (ten je nízkoafinitní s Kd = 200 nM). Pomalejší kinetika NMDA Rs mj. podmiňuje mechanismus časoprostorové sumace (mohou se přidat příspěvky dalších synapsí a navodit depolarizaci nutnou k zahájení akčního potenciálu.

7. Typická excitační synapse (bez KA Rs, které jsou buď pre- nebo postsynaptické podle typu synapse) kyselina kainová NMDA glutamát

8. AMPA a KA receptory: fyziologie a farmakologie • AMPA Rs vedou primárně dovnitř tekoucí sodíkový proud (který je vyvažován ven tekoucím proudem draslíkovým) • některé AMPA Rs neuronů a astrocytů striata, hippokampu či mozečku propouští také Ca2+, což je extrémně důležité pro buňky, které nejsou vybaveny NMDA receptory • selektivní blok AMPA Rs např. silným kompetitivním antagonistou NBQX (6-nitro-7-sulfamobenzo-quinoxalin 2,3-dion); jeho účinek na jiné Rs je velmi slabý nebo 0 • nekompetitivní antagonisté AMPA Rs: některé benzodiazepiny jako GYKI 53655 (slibné v neuroprotekci po mrtvicích; bez vlivu na jiné kategorie glutamátových receptorů AMPA Rs desensitizují po expozici svému ligandu během milisekund, KA receptory v podstatě obratem. Farmakologicky je leze odlišit pomoci jejich odpovědi cyklothiazid a lektin konkavalin A. Cyklothiazid zpomaluje desenzitizaci AMPA Rs bez ovlivnění KA Rs, konkavalin A interaguje s povrchovými cukernými zbytky KA Rs, ale neovlivňuje AMPA Rs.

9. Molekulární složení AMPA a KA receptorů  AMPA Rs: pentamery složené z podjednotek GluR1 – GluR4 (GluRA-D) každá z podjednotek kódována vlastním genem  existuje ve dvou formách, flip a flop vzniklých alternativním sestřihem, lišících se svou distribucí v mozku a dobou desensitizace receptoru nejlépe charakterizovaná podjednotka AMPA Rs: GluR1 s předpokládaným počtem aminokyselin 889 extradélka GluR1 podjednotky je dána neobvykle dlouho N-koncovou extracelulární doménou.

10. Molekulární složení AMPA a KA receptorů • podjednotky AMPA Rs mají pouze tři transmembránové segmenty (nikoliv 4) to, co vypadá jako zkrácený transmembránový segment mezi segmenty M2 a M3, je smyčka, která dvakrát vstupuje do cytoplasmy pro vazbu ligandu je kruciální krátká oblast mezi M1 a M3 transmembránovými segmenty • AMPA receptory bez GluR2 podjednotky jsou vysoce propustné pro Ca2+díky záměně jediné aminokyseliny v smyčce mezi M2 a M3 segmenty Q/R místo: podjednotka GluR2 obsahuje arginin (R), zatímco podjednotky GluR1, 3 a 4 obsahují glutamin (Q).  záměně dochází během speciální editace RNA: gen pro GluR2 podjednotku kóduje glutamin, ale většina mRNA je editována tak, aby obsahovala kodon pro arginin Q/R místo GluR2 podjednotek snižuje vodivost AMPA receptoru a jeho senzitivitu vůči blokádě pavoučími nebo endogenními polyaminy • Ačkoliv AMPA receptory fungují primárně jako iontové kanály, zdá se, že mohou vyvolávat fyziologickou odpověď i jinými mechanismy. Aktivace AMPA Rs může vést i k aktivaci tyrosinkinasy Lyn. Tato aktivace je nezávislá na vtoku sodných i vápenatých iontů. Fyziologický význam tohoto jevu zatím nebyl objasněn.

11. NMDA receptory: fyziologie a farmakologie • při hodnotě membránového potenciálu nižší než cca –50 mV ionty hořčíku (Mg2+) dokáží i v přítomnosti glutamátu nebo aspartátu v podstatě potlačit tok iontů NMDA receptorem Mg2+ se rychle pohybuje z/do otevřeného kanálu a způsobuje rychlé krátké inhibice toků proudů (flickery channel block) nutnost depolarizace (ideálně aspoň o 30 mV) bývají NMDA Rs někdy označovány také jako hybridní kanály (nestačí jim jen ligand) NMDA Rs vedou k Na+ a K+, R vysoce propustný pro Ca2+ permeabilita NMDA Rs pro Ca2+ je asi 10´ vyšší než pro Na+ NMDA Rs procházejí i další bivaletní kationy: Ca2+ > Ba2+ > Sr2+ >> Mn2+ aktivace NMDA Rs za klidového membránového potenciálu může vést k takové depolarizaci, aby navodila vznik akčního potenciálu, zdá se, že primární funkce NMDA Rs spočívá spíše ve zvyšování intracelulárních koncentrací Ca2+ díky synaptické aktivitě ke své aktivaci potřebuje dva agonisty: glutamát a glycin ani jeden z nich sám neotevře kanál NMDA receptoru: koagonisté NMDA Rs vazebné místo pro glycin: cykloserin (původně antituberkulotikum) je slabý parciální agonista; může zesilovat účinek antipsychotických farmak u schizofreniků specifičtější agonisté jako HA966 nejsou v klinické praxi užíváni vazebné místo pro glutamát je rozpoznáváno i strukturně podobnými agonisty, jejichž uhlíkatý řetězec je často prodloužen a navíc w-karboxyskupina je typicky nahrazena zbytkem kyseliny fosfonové (za vzniku antagonisty) takto vzniká skupina kompetitivních agonistů, kteří jsou ovšem polární a téměř neprocházejí hematoencefalickou bariérou (AP-5, 2R-CPPen)

12. NMDA receptory: fyziologie a farmakologie  vazebné místo pro Mg2+ nebo jeho těsné sousedství: sem se váží látky jakofenylcyklidin (PCP, „andělský prach – angel dust“) a farmaka jako ketamin působí jako nekompetitivní antagonisté, kteří okludují kanál receptoru mají značný vliv na funkci mozku v nízkých koncentracích působí psychotomimeticky a navozují kognitivní poruchy (halucinace, iluze) podobné některých symptomům schizofrenie ve vyšších dávkách působí jako disociativní anestetika ketamin je oblíben pediatry – děti nejsou tolik náchylné k vedlejším efektům psychotického typu vysoké dávky ethanolu hraničící s horní hranicí otravy vyvolávají u lidí na NMDA receptorech podobné změny jako fenylcyklidina jemu příbuzné látkypH: protony limitujífrekvenci, s jakou se kanálotevírá, a při pH 6.0 je jeho funkce téměř zcelapotlačena  v jeho aktivaci hrají klíčovou roliionizovatelné aminokys.zbytky jako histidin nebo cystein

13. Vazebná místa NMDA receptoru 5,7-dichlorokynurenová kyselina ketamin PCP

14. Molekulární složení NMDA receptorů  dvě hlavní rodiny NMDA receptorových podjednotek (NR1 a NR2) a jedna malá rodina modulačních podjednotek označovaných jako NR3 podjednotky NMDA Rs v dospělém savčím mozku je tvořena 4 podjednotkami (NR1-NR2 heterotetramery) homotertamerní NMDA receptory složené z NR1 nesou proud asi 100krát menší než NMDA Rs heterotetramerní NR3 podjednotky jsou exprimovány zejména ve vyvíjejícím se CNS a v dospělém savčím mozku nehrají zdá se žádnou roli NR1 podjednotek bylo vyklonováno již více než 9. S NR1 podjednotkami se kombinuji podjednotky NR2, které moduluji farmakologický profil či citlivost kanálu k Mg2+. Zajímavá je časná postnatální výměna NR2B podjednotek v heterotetrameru za podjednotky NR2A. Zatímco původní kanál vyvolával dlouhodobé synaptické odpovědi a byl velmi náchylný k inhibici ifenprodilem, po výměně NR2B podjednotky za NR2A v prvních týdnech života vymizí citlivost NMDA receptoru k ifenprodilu a zkrátí se doba jeho synaptické odpovědi. V páteřní míše jsou rovněž ve vysokých koncentracích exprimovány podjednotky NR2C a NR2D.

15. NMDA receptory: synaptická plasticita  vysoká permeabilita NMDA Rs pro vápník = značný dopad na řadu buněčných funkcí běžná cytoplasmatická koncentrace Ca2+ cca 100 nM po aktivaci NMDA Rs může lokálně stoupnout až na řádově mikromoly  aktivace řady Ca2+-dependentních enzymů (Ca2+/kalmodulin dependentní proteinkinasy, kalcineurin, proteinkinasu C, fosfolipasu A2, NO synthasu a jiné) roku 1973 Bless a Lomo ukázali, že pokud je vysokofrekvenčně stimulován aferentní axon, který inervuje právě depolarizovanou postsynaptickou buňku, vyvolá odpověď daleko větší, než by odpovídalo odpovědi po stimulaci membrány nedepolarizované jev byl patrný ještě řadu hodin po prvním vysokofrekvenčním dráždění a opakované episody stimulace jej mohly vyvolat i několik týdnů dnes označováno jako LTP a považován za jeden z mechanismů tvorby paměťové stopy

16. LTP na molekulární úrovni  potřeba stimulačního vstupu působícího na již depolarizovanou postsynaptickou membránu vzpomeňte si, že AMPA Rs potřebují ke své aktivaci jen výlev glutamátu (presynaptickou aktivitu), a jsou schopny navodit depolarizaci postsynaptické membrány NMDA Rs potřebují ke své aktivaci navíc ještě depolarizaci v řádu cca tří desítek mV (aktivitu postsynaptickou) po otevření NMDA Rs a vtoku vápníku do postsynaptického elementu dochází k další depolarizaci mechanismus vzniku LDT (dlouhodobého aktivitně závislého poklesu synaptické účinnosti) je téměř identický jen je zapotřebí nižších koncentrací vápníku Souvisí to pravděpodobně s kompeticí kinas a fosfatas. Při vyšší koncentraci vápníku je přednostně stimulována CaM kinasa II – enzym s nižší afinitou k vápníku, a dochází k fosforylaci AMPA receptorů. Naopak při LTD se vápník při svých nižších koncentracích přednostně váže na kalcineurin – enzym s vyšší afinitou k vápníku, který pak stimuluje proteinfosftasu 1. Ta AMPA receptory defosforyluje.

17. LTP a LTD na molekulární úrovni

18. Metabotropní glutamátové receptory (mGluRs) • zatím naklonováno 8 různých podjednotek mGluRs označovaných jako mGluR1-8 a dělených do tří tříd tyto receptory jsou větší než jiné receptory spřažené s G-proteiny potence glutamátu varírují mezi 2 nM pro mGluR8 po 1 mm promGluR7 míra homologie s nimi není příliš vysoká ale vyznačují se velice dlouhou N-koncovou doménou, která extracelulárně předchází transmembránovým segmentům. v rámci jednotlivých tříd mGluRs existuje asi 70% sekvenční homologie mezi třídami pak homologie asi 45% Rozdělení do tříd je založeno na základě mechanismu přenosu signálu: • • skupina I stimuluje fosfolipasu C cestou Gq proteinů• skupina II a III inhibují adenylylcyklasu cestou Gi proteinů a regulují specifické Ca2+ a K+ iontové kanály • vysoce selektivní agonisté pro každou z těchto tří skupin mGluRs skupinu I mGluRs agonisticky ovlivňuje DHPG (3,5-dihydroxyfenylglycin) pro skupinu II je vysoce selektivním a středně potentním agonistou APDC (2R,4R-4-aminopyrrolidin-2-4-dikarboxylát)  modelovým agonistou skupiny III je L-AP4 (L-amino-4-fosfonobutyrát). V současnosti probíhají klinické testy se selektivním agonistou II skupiny mGluRs označovaným jako LY354740, který by mohl být jarmakem terapie úzkostných stavů a možná i antipsychotikem.

19. Modulace aktivity iontových kanálů cestou metabotropních Glu Rs  modulují velmi různorodým způsobem funkci řady ligandem ovládaných i napěťově závislých iontových kanálů v neuronech CNS L-AP4 působí na skupině III mGluRs v bipolárních neuronech sítnice a způsobuje hyperpolarizaci jejich membrány – glutamát obvykle centrální neurony depolarizuje (hyperpolarizace navozena cestou G-proteinů aktivujících fosfodiesterasu, která  hydrolyzuje cyklické nukleotidy normálně udržující Na+ kanály otevřené) aktivace mGluRs vede k stimulaci L–typu napěťově ovládaných Ca2+ kanálů, mGluRs třídy II a II regulují také N-typ Ca2+ kanálů v hippokampu nebo na cholinergních neuronech putamenu uzavírají napěťově ovládaných K+ kanálů  pomalá depolarizace a excitace neuronů na granulárních buňkách mozečku vede aktivace mGluRs k poklesu aktivity Ca2+-dependentních draslíkových kanálů (označovaných jako BK kanál) a snížení excitability buňky presynapticky na glutamátergní synapsi tyto presynaptické mGluRs inhibují P/Q typ Ca2+ kanálů a tím inhibují výlev neuropřenašeče (inhibiční autoreceptory).

20. Modulace aktivity iontových kanálů cestou metabotropních Glu Rs

21. Autoimunitním atak receptorových podjednotek GluR3: Rasmussenova encefalitida Jde o chorobu propukající v raném dětství a spojenou s epilepsií a progresivní degeneraci jedné z mozkových hemisfér. léze s lokálním otokem mozku (parietální a okcipitální lalok) těžký otokpravé mozkové hemisféry, posun středových struktur

22. GABA (kyselina g-aminomáselná) • GABA = hlavním inhibičním neuropřenašeč savčího CNS GABAergní neurony zahrnují velmi různorodě skupiny neuronů (interneurony inhibiční až neurony projekční) GABA jako neuropřenašeč ryze inhibiční, který hyperpolarizuje membrány postsynaptických buněk? NE: role GABA je komplexnější např. během vývoje CNS může GABA působit i jako transmiter excitační, navozující depolarizaci membrány GABA uvolňovaná z inhibičních interneuronů malých lokálních obvodů se spoluúčastní generování membránových oscilací (např. theta rytmy EEG) GABAergní funkce alterovány v případě řady neuropsychiatrických onemocnění jako epilepsie, Huntingtonova choroba, dyskineze, alkoholismus či poruchy spánkového rytmu Syntéza a odbourávání GABA GABA určená pro synaptický přenos vzniká v metabolických drahách souhrnně označovaných jako tzv. GABA shunt. Podobně jako při syntéze glutamátu je obecným prekursorem GABA glukosa, jako prekursor může sloužit i pyruvát. GABA je plněna do váčků v terminále pomocí vesikulárního transportéru pro GABA. jeho primární sekvence naznačuje, že je složen z 10 transmembránových segmentů a velmi dlouhé cytoplasmatické N-koncové smyčky o délce asi 130 aminokyselin. Podobně jako VGluT je i tento transportér závislý na elektrickém gradientu na membráně váčku. Jeho specifické inhibitory zatím nejsou známy.

23. Prvním krok syntézy GABA: konverze a-ketoglutarátu na glutamát působením enzymu a-oxoglutaráttransmaminasa (GABA transaminasa nebo též GABA-T) • Následuje dekarboxylace kyseliny glutamové (dekarboxylasou kyseliny glutamové, GAD) na GABA. • Po výlevu je GABA vychytávána zpět do neuronů nebo glií.V gliích je metabolizována na sukcinylsemialdehyd pomocí GABA-T. Tento transaminační krok probíhá v gliích tehdy, když je přítomen i a-ketoglutarát, aby mohl sloužit jako akceptor aminoskupiny odštěpené z GABA. Ten je posléze konvertována na kyselinu glutamovou a ta transportována zpět do neuronů (glie neobsahují GAD),kde je přeměněna na GABA. Jsou známy specifické inhibitory pro GABA-T, které jsou vyvíjeny jako antikonvulsativa. Velmi slibné klinické výsledky má zatím např. vigabatrin.

24. Farmakologie výlevu a zpětného vychytávání GABA Výlev standardní cestou (blokuje jej např. antikonvulsativum gabapentin; mechanismus jeho působení ale zatím není popsán)  reuptake za přítomnosti extracelulárního Na+ a Cl: dva ionty sodíku a jeden ion chloridový jsou přeneseny s každou molekulou GABA Pomocí klonování byly odlišeny čtyři (původně byla očekávána nižší heterogenita) různé GABA transportéry: GAT-1, GAT-2, GAT-3 a BGT-1. Inhibitory zpětného transportu GABA : farmakologicky důležité, profily transportérů se lišíInhibicí vychytávání GABA všechny tyto látky zvyšují její dostupnost v synaptické štěrbině atím potencují její inhibiční efekt v rámci CNS. GAT-1 transportér •hydroxynipekotová kyselina:na membráně glií, její selektivita pro gliáílní transportéry je asi 20 vyšší než pro transportéry na membráně nervové terminály •příbuzné inhibitory kyselina nipekotová a guvacin blokují obojí transportéry přibližně se stejnou afinitou jako hydroxynipekotová kyselina(IC50 = 20-40 mM) •L-DABA (2,4-diaminomáselná kyselina) a ACHC jsou přibližně 4 méně účinnější •b-alanin, hypotaurin a taurinvykazujíještěnižší potenci vůči GAT-1 •NNC-711:jeden z nejpotentnějších inhibitorů GAT-1 transportéru, lipofilní derivát guvacinu(jeho IC50je menší než 400 nM; inhibuje i transport přes GAT-3 transportér, ale se zhruba 40 000 nižší selektivitou) • antikonvulsanta tiagabin a lipofilní inhibitory Cl-966 a SKF89976.

25. GAT-2, GAT-3 a BGT-1 transportér • Farmakologické profily transportérů GAT-2 a GAT-3 se od profilu GAT-1 liší. • GAT-2 a GAT-3 vykazují výrazně nižší afinitu ke guvacinu a kyselinám nipekotové i hydroxynipekotové, stejně jako k b-alaninu, hypotaurinu a taurinu • transportér BGT-1 (primárně lokalizován v ledvinách) má také odlišnou farmakologii: je inhibován např. phloretinem a quinidinem • velmi slabými antagonisty BGT-1 jsou i b-alanin, L-DABA a nipekotová kyselina • Tricyklická a tetracyklická antidepresiva: • desiparamin a maprotilin inhibují všechny subtypy GABA transportérů se zhruba stejnou potencí • jejich afinita ke GABA transportérům je ale výrazně nižší než např. ke transportérům pro serotonin • naopak amytriptylin blokuje zpětný transport GABA přes GAT-1 a GAT-3 s afinitou jen asi 10´ nižší než je jeho afinita pro serotoninový transportér • zda tyto látky svým působením na transportéry GABA potencují své působení jako antidepresiv, není zatím známo desipramin maprotilin

26. GABA receptory Podobně jako glutamátové receptory lze i GABA receptory rozdělit do dvou velkých funkčních skupin: ionotropní GABAA (a GABAA-r = GABAA rhó receptory nazývané též ev. GABAC) receptory formující chloridový kanál a metabotropní GABAB receptory, spřažené s G-proteiny. GABAA a GABAC receptory  pentamerické iontové kanály propustné pro chloridy první klonování podjednotek GABAA R v roce 1987, zatím 16 lidských podjednotek: • 6 α podjednotek (GABRA1, GABRA2, GABRA3, GABRA4, GABRA5, GABRA6) • 3 β podjednotky (GABRB1, GABRB2, GABRB3)• 3 γ podjednotky (GABRG1, GABRG2, GABRG3) • δ podjednotka (GABRD) • ε podjednotka (GABRE) • π podjednotka (GABRP) a • θ podjednotka (GABRQ)

27.  podjednotky o velikosti asi 50 kDapodobná membránovou topologii: dlouhou extracelulární N-koncovou doménu, 4 a-helikální transmembránové segmenty (M1-M4) a krátkou extracelulární C-koncovou doménu podjednotky mezi sebou vykazují 70-80% homologii (krysy) evolučně patří do superrodiny receptorů s receptory acetylcholinovými, glycinovými a 5HT3 receptory vykazují s nimi asi 25% homologii diversifikovaly via duplikace a mutacem společného genového předka • vysoká heterogenita GABAA receptorových podjednotek: alternativní sestřih např. dvě různé verze g2 nebo b2 podjednotek: isoformy se liší přítomností krátké peptidové sekvence mezi transmembránovými segmenty M3 a M4, která obsahuje fosforylační místo pro proteinkinasu C alternativní sestřih popsán i u podjednotek a6, a5 a b3  GABAA receptory = heteropentamery navzájem se kombinují a, b, g a d podjednotkynejčastější podjednotková kombinace v CNS = 2a-2b-1g teoreticky téměř 2000 různých GABAA receptorových kombinací nejčastější podjednotkou je pravděpodobně a1, komplementární zpravidla podjednotka a3a2 podjednotka zejména v regionech, kde je a1 méně četná (hippokampus, striatum, čichový lalok)a6 podjednotka je exprimována téměř výlučně v mozečku

28. GABAA-r (GABAA rhó) nebo také GABAC receptory jsou podtřídou ionotropních GABA receptorů. Jde s největší pravděpodobností o homopentamerické receptory složené z r podjednotek, které tvoří tři receptorové subtypy. Byla prokázána také heterokombinace s g2 podjednotkou GABAA Rs. V CNS se v podstatě nevyskytují, převládají v horizontálních a bipolárních buňkách sítnice.

29. Farmakologie GABAA receptorů Farmakologie GABAA Rs se odvíjí od 70. let, kdy badatelé experimentálně zjistili, že křeče navozující alkaloid bikukulin antagonizuje určité inhibiční působení GABA (toto pozorování mj. vedlo i postulování GABA jako hlavního inhibičního neuropřenašeče). Farmaka se na GABAA Rs váží na různých místech: kompetitivní antagonisté a kompetitivní agonisté se obvykle váží na vazebné místo pro GABA, které obvykle leží na b podjednotkách. Látky okupující vazebné místo pro GABA: • bikukulin• další kompetitivní antagonisté jako pitrazepin• křeče navozující securinin• steroidový analog RU5135• pyridazinylový derivát gabazin• dále selektivní agonisté muscimol, isoguvacin, THIP (4,5,6,7-tetrahydroisoxazolo[5,4-c]-pyridon) nebo piperidin-4-sulfonovou kyselinu Látky okupující vazebné místo poblíž chloridového póru • silné konvulsanty fenylentetrazol a pikrotoxin (a příbuzný pikrotixinin)  brání toku chloridových iontů.

30. GABA a antagonisté GABAA Rs

31. Benzodiazepinové(BZD) vazebné místo • účinek benzodiazepinů (BZD) prokázán už počátkem 70. let BZD potencují GABAergní inhibiční transmisi přímo vazbou na GABAA receptory benzodiazepinové místo leží jinde než vazebné místo pro GABA a je čistým allosterickým modulačním místem na GABAA Rs pentamerug podjednotka není přímo součástí vazebného místa pro BZD, ale je pro jeho zformování nezbytná látky vážící se na BZD místo jsou plní agonisté až plní inverzní agonisté zvyšují (agonisté) afinitu GABAA Rs k vazbě GABA do jejího vazebného místa a tím zvyšují frekvenci otevírání chloridového kanálu, nebo ji naopak snižují (antagonisté) • mezi agonisty na BZD vazebném místě patří anxiolytika diazepam, chlordiazepoxid, lorazepam a alprazolaminverzní agonisté mají tendence způsobovat křeče (inhibice inhibice!) či úzkostné stavy a patří mezi ně látky jako b-karbolin nebob-CCEantagonisté jako flumazenil se váží do BZD místa, ale sami funkci GABAA Rs nemění; blokují ovšem funkci agonistů či inverzích agonistů anatgonisté používáni při terapii předávkování benzodiazepinovými agonisty Odpověď GABAA Rs na vazbu látek do BZD se velmi liší podle receptorového složení. Mnoho těchto farmak vyvolává ax-podjednotka specifický efekt, což vede k zajímavým klinickým výstupům. diazepam

32. Sedativa, hypnotika či anestetika na GABAA R • Barbituráty • pentobarbital a fenobarbital; fenobarbital byl používán jako antikolvunsant již zkraje 20. století zvyšují dobu otevření chloridového kanálu a maximalizují možnost toku chloridů do buňky senzitivita buňka k barbiturátům není ovlivněna podjednotkovým složením GABAA Rs podobným mechanismem pravděpodobně účinkují i neuroaktivní steroidy – allostericky regulují funkci GABAA Rs ve smyslu zvýšení či snížení chloridové propustnosti • Ethanol • prodlužuje dobu otevření chloridového kanálu a facilituje schopnost GABA aktivovat receptorg2 podjednotky, které se vyskytují při alternativním sestřihu v kratší a delší variantě, ovlivňují citlivost receptorového komplexu k ethanolu ethanol zesiluje účinek GABA jen v receptorech obsahujících delší formu g2 podjednotky. Tato sestřihová varianta obsahuje i sekvenci pro fosforylací proteinkinasou C; pokud je poškozena, receptor svou sensitivitu k ethanolu ztrácí • !!! ethanol, BZD a barbituráty působí podobným mechanismem na stejném receptorovém substrátu  současné užívání těchto látek způsobuje klinické komplikace !!! farmakologický synergismus zvyšuje možnost předávkování a může vést ke vzniku křížové závislosti

33. Při alkoholovém detoxu jsou pak BZD lékem volby: bývají užity k potlačení abstinenčních příznaků jako halucinací, deliria tremens a křečí.Dlouhodobé užívání BZD vede k toleranci některých jejich účinků, zejména se snižuje jejich protikřečový a sedační efekt, takže jejich dlouhodobé užití v terapii nespavosti či epilepsií je limitováno. Kupodivu, tolerance k anxiolytické složce jejich účinku nevzniká. Tato tolerance pravděpodobně vzniká expresí podjednotek bez BZD vazebného místa, pokud jsou benzidiazepinová farmaka užívána dlouhodobě. Na GABAA Rs působí také inhalační anestetika. Jejich vazebné místo se typicky vyskytuje poblíž extracelulární oblasti transmembránových segmentů M2 a M3. Mezi tyto látky patří např. enfluran. Jak už jsem zmiňovala, některá farmaka působící na GABAA Rs vyvolává ax-podjednotka specifický efekt, což vede k zajímavým klinickým výstupům. Antagonista BZD vazebného místa nazvaný RO 15-4513 působí jen na GABAA Rs obsahujících a6 podjednotku. Ta je koncentrována v mozečku a RO 15-4513 redukuje ataxii navozenou ethanolem, aniž by měnil další účinky ethanolu. Na GABAA Rs obsahujících a1 podjednotku působí zolpidem, non-BZD sedativum, které se váže do BZD místa GABAA receptorů. Farmakologové se snaží vyvíjet ligandy GABAA receptorů, jež by nespouštěly vznik závislosti a na které by nevznikala dlouhodobá tolerance.

34. GABAB receptory  GABAB receptory původně identifikovány díky své schopnosti vázat bikukulin a další ligandy GABAA receptorů. až později se začalo pracovat s GABA analogem a svalovým relaxantem baklofenem(silný agonista GABAB receptorů) metabotropní receptory spřažené s G-proteiny třídy Gi lokalizovány presynapticky i postsynapticky obsahují typických 7 transmembránových segmentů větší než většina receptorů spřažených s G-proteiny, jejich délka je 850-960 aminokyselin. Strukturně jsou podobny mGluRs. Byly naklonovány dvě hlavní skupiny GABAB receptorových podjednotek: GABABR1a a R1b. Obě jsou spřaženy s Giproteiny.  vyklonována i podjednotka GABABR2 schopná heteromerizace s ostatními podjednotkami ve funkční receptor. Toto byl první příklad receptoru spřaženého s G-proteinem, který funguje jako multimerický komplex. Účinky GABAB receptorů zahrnují zejména ·•otevírání draslíkových kanálů ·• pokles vápníkové vodivosti a • inhibici adenylymlcyklasy.

35.  ve srovnání s GABAA receptory navozují GABAB receptory odpověď s pomalejším nástupem, ale delší dobou trvání odpověď vyvolaná GABAB receptory ale vyžaduje stimulus o větší síle a delší době trvání než v případě GABAA receptorů, což je možná dáno tím, že jsou lokalizovány i extrasynapticky GABAA receptory leží na synapsi přímo proti místu výlevu a k aktivaci jim teoreticky stačí uvolnění jediného kvanta GABA, zatímco ke stimulaci receptorů extrasynaptických se musí uvolnit GABA tolik, aby k nim dodifundovala.  presynaptické GABAB Rs = autoerceptory inhibující další výlev GABA z GABAergního nervového zakončení pokud jsou GABAB receptory lokalizovány na excitačních nervových zakončeních, vede jejich stimulace ke poklesu výlevu glutamát mohou inhibovat také výlev dalších neuropřenašečů jako noradrenalinu, dopaminu, serotoninu či substance P. Ve všech případech dochází k této inhibici snížením vodivosti Ca2+ kanálů a poklesem vtoku vápníku do zakončení. Na inhibici se může spolupodílet i zvýšená vodivost pro draslík. Přehled selektivních ligandů GABAB Rs máte v doprovodném textu. Obecně je využíván např. baklofen v terapiích vedoucích ke snižování spasticity, v budoucnu snad budou dostupná farmaka použitelná v terapii úzkosti, křečí či deprese.

36. Glycin většina glycinu v CNS savců je syntetizována de novo z glukosy přes serin serin je následně konvertován na glycin enzymemserinhydroxymethyltransferasou (SMHT), což je enzym pyridoxalfosfát-dependentní. (Pyridoxalfosfát je derivát vitamínu B6.) Tato konverzeprobíhá s největší pravděpodobností v mitochondriích - distribuce mitochondriální SMHT kopíruje distribuci glycinu.  inhibiční neuropřenašeč, který se účastní neurotransmise převážně v mozkovém kmeni a páteřní míše degradace glycinu se děje převážně cestou systému štěpení glycinu (glycine cleavage system, CGS), který zahrnuje 4 enzymyCGS je lokalizován na vnitřní mitochondriální membráně a jeho poruchyzpůsobují skupinu metabolických onemocnění souhrnně označovaných jako nonketotické hyperglycinemie typická je pro ně vysokákoncentrace glycinu v CSF

37. Uvolňování a zpětné vychytávání glycinu  ze synaptické štěrbiny je zpětně vychytáván transportéry lokalizovanými na membráně přilehlých glií, stejně jako na membráně presynaptického zakončení proti svému koncentračnímu gradientu je zpět do buněk přenášen pomocí kontransportu se 2 Na+ a 1 Cl- transport je tedy elektrogenní a vede k vtoku kladného náboje do buňky Dvě skupiny glycinových transportérů: GLYT1 a GLYT2 GLYT1  existuje ve třech variantách vzniklých alternativním sestřihem nejsou známy rozdílné transportní charakteristiky těchto transportérů, ale byla popsána jejich různá distribuce v rámci CNS jen GLYT1 transportér je -oproti GLYT2- citlivý k sarcosinu (N-methylglycinu) oba typy transportérů jsou lokalizovány v kaudální části CNS GLYT1 je exprimován i v těch málo oblastech koncového mozku, které souvisí s glycinergní transmisí tam reguluje GLYT1 NMDA glutamátové receptory: glycin je jejich allosterický modulátor a GLYT1 upravuje jeho dostupnost (tj. extracelulární koncentraci) inhibitory GLYT1 transportéru tedy mohou posilovat funkci NMDA receptorů GLYT1 je exprimován v neuronech i astrocytech, GLYT2 jen v zakončeních glycinergních neuronů

38. Glycinové receptory (Gly Rs) • primárně se vyskytují v mozkovém kmeni a páteřní míše formují iontový kanál s propustností pro chloridy podobné velikosti jako GABAA Rs (okolo 250 kDa) a podobně jako ony s největší pravděpodobností formují pentamerickou strukturu, která obklopuje vodou naplněný pór pro průchod iontů!!! Glycinové receptory nejsou identické s vazebným místem pro glycin na NMDA glutamátových receptorech a farmakologicky je lze odlišit vazbou strychninu !!! strychnin = selektivní antagonista Gly Rs a silný konvulsant  agonisté Gly Rs jsou kompetitivní a není jich popsáno mnoho podle potence se řadí obvykle následujícím způsobem: glycin > b-alanin > taurin > L- a D-alanin > L-serin >> D-serin mezi další agonisty patří např. cykloserine, dimethylglycin, hypotaurin, methylglycin (sarcosin), betain (trimethylglycin) nebo Milacemid nekompetitivní inhibitory některých Gly Rs se váží přímo na receptorový iontový kanál a blokují tok chloridových iontů. Patř mezi ně např. pikrotoxin a jeho derivát pikrotoxinin. Mezi další antagonisty patří např. bikukulin, kofein, cyanotrifenylborát (CTB), strychnin nebo tutin strychnin

39. Glycinové receptory (Gly Rs) • naklonovány čtyři a podjednotky (geny GLRA1-4) a jedna samotnými b podjednotka od každé podjednotky jsou známy sestřihové varianty složení Gly Rs se mění během ontogenese  v krysích embryích byly detekovány výhradně a2 podjednotky Gly Rs adultní formy GlyRs jsou obvykle heteropentamery složené ze 3 a1 podjednotek a 2 b podjednotek. chloridová vodivost homopetnamerních Gly Rs složených z a2 podjednotek je výrazně vyšší než u jiných homopentamerů nebo heteromerů: existuje ontogenetický pokles vodivosti Gly Rs způsobený kratší dobou jejich otevření vzrůst transkripce a3podjednotek během vývoje se omezuje jen na infralimbický systém (hippokampus a granulární buněčnou vrstvu mozečku)b podjednotky se kupodivu (resp. jejich mRNA) vyskytují v celém dospělém savčím CNS, ačkoliv tyto podjednotky samotné nemohou zformovat glycinový receptor Mutace v a1 podjednotce glycinového receptoru vedou k dominantně děděné chorobě zvané hyperekplexie. Jde o bodovou mutaci v pozic 271 na a1 podjednotce, která způsobí více než stonásobný pokles afinity receptoru pro glycin. Velmi typický je pro tuto chorobu vysoký svalový tonus. Pacienti vykazují tzv. startle reflex – po neočekávaném taktilním nebo zvukové podnětu „ztuhnou“, kontrahují jim svaly končetin a někdy mrkají.

40. Glycinový receptor (Gly s) • protein složený z několika různých podjednotek • gephyrinová podjednotka na cyto- plamatické straně membrány (vazba Gly R na cytoskelet) • část Gly R vázající glycin složena z 5 alfa a 1-2 beta podjednotek • vlastní pór tvoří pět alfa (48 kDa) podjednotek • pór kanálu by neměl mít o moc větší průměr než 5,2 Å (selektivita) • a podjednotky také tvořeny segmenty M1-M4 (podobně jako nAChRs, GABAA Rs – evoluční příbuznost) • propouští Cl- ionty • vazebné místo pro strychnin je na alfa podjednotce Gly R :   48 kDa, b  58 kDa  93 kDa polypetid gephyrin

41. Co si pamatovat z dnešní přednášky • glutamát: receptory, farmakologie • GABA: receptory, farmakologie • glycin: receptory, farmakologie