זיהוי מעבדתי של שפעת עופות בבני אדם

1. זיהוי מעבדתי של שפעת עופות בבניאדם ד"ר יעל שלו וצוות מדור דרכי נשימה המעבדה מרכזית לנגיפים תל השומר

2. סיווג נגיף השפעת לתתי זנים • נגיף השפעת שייך למשפחת שייך ה- Orthomyxoviridae. • נגיף השפעת בנוי מחלקיקים((ssRNA בעלי מעטפת המכילה את הגליקופרוטאינים:נוירואמינידז והמאגלוטינין. • המגלוטינין באמצעותו נקשר הנגיף אל התא המאכסן כשלב הכנה לחדירותו. • נוירואמינידז פועל על שיירי הסוכר של גליקופרוטאינים שמצויים על פני התא המודבק ובזאת ומקל את שחרורם של צאצאי נגיף בשלים מהתא. • חלבוני מצע חלבוני מבנה המשמשים לקשירת הנוקלואוקפסיד אל הגליקופרוטאינים ובכך מקנים חוזק למעטפת. Orthomyxoviridae InfluenzaA BC Togotovirus H1N1, H3N2 , H1N2 A/Yamagata, A/New Caledonia A/Sydney A/Panama

3. Structure of Influenza A Virus

4. אפידמיולוגיה ומניעה חיות אדם H1-H15 N1-N9 N1-N2 H1-H3 לנגיףהשפעת יכולת לעבור ממאכסן למאכסן למשל מעופות לאדם .קיימיםדיווחים על הדבקה באדם של H7N7, H5N1ׁ(הולנד 03,סין 03). במידה ויגיע זן כזה הוא יזוההבReal Time PCR(Taqman)- כ- FluA משום שאזור ה-Matrix זהה. לאחר מכן ישלח לקביעת רצףובו ,זמנית יאופיין אנטיגניתבעזרת .HI וירוס שפעת Shift Drift

5. Drift ו-Shift ותפקידם באפידמיולוגיה Shift אנטיגני נובע בדרך כלל מערבוב (reassortment)של חומר גנטי בין שני תת זנים שונים וכתוצאה נוצר תת זןשונה לגמרי שכנגדו לאוכלוסיהאין הגנה.מאורע כזה מלווה בדרך כלל בפנדמיה ומשפיע על אוכלוסיה נרחבת בעולם. Driftאנטיגני נובע מהתרחשות מוטציה נקודתית בהמאגלוטינין הוירלי שכתוצאה ממנה הנוגדנים שמקנים הגנה לא נקשרים באותה יעילות לאפיטופים המוטנטים.התרכיב מאבד את ההשפעה המגנה ככל שה- Drift ממשיך. H3N2 H1N1 H1N2

6. מקור ה-shift האנטיגני ופנדמיות ב Influenza

7. התפרצויות קודמות של שפעת עופות בעולם

8. התפרצויות אחרונות של H5N1

9. Standard case definition for reporting of laboratory-confirmed cases of Influenza A/H5 viral infection established by the WHO A confirmed case is an individual alive or deceased, in whom laboratory testing demonstrates one or more of the follwing: - Positive viral culture for Influenza A/H5.- Positive polymerase chain reaction (PCR) for Influenza A/H5.- Positive immunofluorescence antibody (IFA) test for H5 antigen usingH5 monoclonal antibodies.- 4 fold rise in H5-specific antibody titer in paired serum samples.

10. פעילות המעבדה באבחון שפעת עופות • התרחשות מגיפה של H5N1 בעופות ומקרים ספורדים של מוות בבני אדם במזרח הרחוק. • מתקבלת החלטה: הכנת המעבדה לאבחנת H5 בבני אדם.

11. מקורות חומרים למחקר • cDNA של A/Vietnam/1194/044מארגון הבריאותהעולמי. • RNA של H9,H7,H5מהמכון הווטרינרי. • וירוסים מומתים H9,H7,H5 על ידי בתה פרופיולקטון (BPL) מהמכון הווטרינרי.( בדיקת וירולנטיות בביצים מופרות)

12. המטרה בניית יכולת זיהוי דגימות קליניות החשודות ל H5 ע"י Real Time PCR

13. תוצאות הרצת תוצרי RT-PCR לאחר ניקוי ולפני משלוח ל- sequence 1- מרקר 2- מים 3- תוצר RTשלH5N3עם פרימרים ל-Flu A 4- תוצר RTשל H7 עם פרימרים ל-Flu A 5- תוצר RTשל H9עם פרימרים ל-Flu A 6- תוצר RT של H5N3 על ידי Taqmanעםפרימרים ל-Flu A 7-תוצר RT של,cDNAשהופק מווירוס H5N1 A/Vietnam 1194/04עם פרימרים ל-H5 8-RT של וירוס מומת H5N3 עם פרימרים ל-H5 1 2 3 4 5 6 7 8 188 bp 351 bp

14. סיכום יכולות הזיהוי המעבדתי • זיהוי דגימות קליניות החשודות ל:H1,H3,H7,H9כ-Flu A ב- PCR Real Time (Taqman) • דגימה החשודה ל H5 תזוהה בזמן הקרוב ב .Taqman יוזמן Probe מתאים לפי: Spackman et al J Clin Micro ,2002 • זיהוי דגימה החשודה ל H3,H5,H7,H9,H1 כ- Flu A ב RT- PCR עם פריימרים לmatrix . • זיהוי ספציפי של דגימה החשודה ל H5 עם פריימרים ספציפיים להמאגלוטינין. • כביקורת חיובית ישמש cDNA של A/Vietnam 1194/04

15. Alignment של רצף חומצות אמינו שלהמאגלוטיניןמוירוסיםH5HK97 ו-CkHK97 Class et al 351 ,1998

16. Alignment של רצף חומצות אמינו שלהמאגלוטיניןמוירוסיםH5HK97 ו-CkHK97

17. Alignment של רצף חומצות אמינו של הנוירואמינידז (N1) H5N1 H7N1

18. השוואה של ההומולוגיה של החומצותהאמיניותוהנוקלאוטידים של סגמנטי HK97ו-CkHK97

19. עץ פילוגנטי שמבוסס על הרצף של HK97 ו-CkHK97

20. מסקנות מעבודתם של Class et al 1998 • מבנה הנגיף שבודד מהאדם HK156 /97 דומה מאוד מבחינת רצף החומצות האמיניות של ההמאגלוטינין לנגיף שבודד מעופות CkHK97 • נמצאו שלושה הבדלים בחומצות אמינו אשר אף אחד מהם לא נמצא ב-receptor binding site • לא ידוע אם ההבדלים הבודדים הללו הם שאפשרו את המעבר הישיר מעופות לבני אדם. • אנליזה של רצף של כל סגמנטי הגנים הראתה ש -HK156 /97 קרוב מאוד מבחינה גנטית לנגיף שבודד מעופות CkHK97

21. העברה של H7N7 מעופות לאדם במשך התפרצותבחוות גידול עופות בהולנד 2003 • Coopmans et al, Lancet 363 2004 • בסוף פברואר 2003 ארעה התפרצות ב-6 חוות לגידול עופות שהתפשטה ל-255 חוות. • מניעת ההתפשטות על ידי הרג 30 מליון תרנגולות שהם 28% מאוכלוסית התרנגולות ומהווה ענף יצוא חשוב. • האדם שנפטר היה במקצועו מנתח וטרינרי שביקר בחווה.הוא נפטר מ-Acute respiratory distress. • מרבית החולים אובחנו כסובלים מ Cojuctivitis בלבד ומספר קטן סבלו ממחלה שקשורה בדרכי הנשימה. • הוירוס שבודד מהפרשות בעין אובחן כ-H7N7 על ידי RT-PCR ובידוד בתרבית.אנליזה של רצף הגנים מבידוד מאדם הראתה שהואקרוב מבחינה גנטית לנגיף שבודד מעופות • ישנו דווח על מחלתם של בני משפחת עובד חווה (האשה הבת והסבא) העברה מאדם לאדם?