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Ogni proteina posso clonarla in infiniti modi: Come scelgo le sequenze a.a. da clonare?

Ogni proteina posso clonarla in infiniti modi: Come scelgo le sequenze a.a. da clonare? Su quali parametri posso basarmi per scegliere bene?. Scelta delle sequenze da clonare. Rational design : Omologie di sequenze con proteine note

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Ogni proteina posso clonarla in infiniti modi: Come scelgo le sequenze a.a. da clonare?

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Presentation Transcript

  1. Ogni proteina posso clonarla in infiniti modi: Come scelgo le sequenze a.a. da clonare? Su quali parametri posso basarmi per scegliere bene?

  2. Scelta delle sequenze da clonare • Rational design: • Omologie di sequenze con proteine note • Identificazione di domini funzionali mediante predizioni di struttura 2D e 3D

  3. Cloning Gene constructs design primers • Small, globular proteins (full length protein) • Larger and/or multi-domain proteins -full length protein -choose one or more domains (domains boundaries!) Well folded Most likely unfolded Use structure prediction and multiple sequence alignments to design shorter constructs not to cut secondary structure elements http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/

  4. RICERCHE BIOINFORMATICHE • SEQUENZA NUCLEOTIDICA GeneBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez Ensembl http://www.ensembl.org/index.html • SEQUENZA PROTEICA E INFORMAZIONI SULLA PROTEINA Swissprot websitehttp://www.ebi.ac.uk/swissprot/ ExPASy Proteomics Serverhttp://www.expasy.org/proteomics Uniprot http://www.uniprot.org/ • INFORMAZIONI SU SNPs(is a free public archive for genetic variation within and across different species) dbSNPs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ • RICERCHE DI OMOLOGIE E DOMINI CONSERVATI BLASThttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome Pfam http://pfam.sanger.ac.uk/ SMART http://smart.embl-heidelberg.de/

  5. RUN BLAST

  6. Pfam

  7. Pfam

  8. Pfam

  9. http://smart.embl-heidelberg.de/smart/job_status.pl?jobid=150217145174205841319494839vVWWzOodNAhttp://smart.embl-heidelberg.de/smart/job_status.pl?jobid=150217145174205841319494839vVWWzOodNA

  10. ALLINEAMENTI DI SEQUENZE ClustalWhttp://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_clustalw.html • INFORMAZIONI STRUTTURALI PDB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do • PREDIZIONE DI REGIONI TRANSMEMBRANA http://www.sbc.su.se/~miklos/DAS/ http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/, http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED/form.html • PREDIZIONE DI SEQUENZE SEGNALE http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ • PREDIZIONI TOPOLOGICHE IUPREDhttp://iupred.enzim.hu/ FoldIndexhttp://bip.weizmann.ac.il/fldbin/findex

  11. SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html

  12. TMHMM Server v. 2.0 Prediction of transmembrane helices in proteins http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/

  13. PREDIZIONE DI SEQUENZE SEGNALE

  14. LOOK FOR DISORDERED REGIONS IN THE SELECTED CONSTRUCT http://bip.weizmann.ac.il/fldbin/findex

  15. ALTRE ANALISI DI SEQUENZA Presenza di codoni rarihttp://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC N-end rule(Varshavsky,A. (1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93, 12142-1214)

  16. Il codice genetico or T or T

  17. Rare codons (codon Bias) • The frequency of codons are different among different organisms • Codon analysis programs are available on line

  18. Espressione di SOD1 umana (HSOD) Amplificazione del gene SOD1 da cDNA umano via PCR Preparazione del vettore (plasmide) di espressione Inserimento del gene in vettore di espressione Trasformazione del vettore in ceppo di E. coli Screening delle colonie Coltura batterica  Isolamento della proteina  Purificazione  Caratterizzazioni biofisiche preliminari

  19. Amplificazione del gene SOD1 Direct Primer Inizio seq. SOD trascritta Reverse Primer

  20. Condizioni di reazione H2O sterile 36.5 l Buffer per Taq (10 x) 5.0 l dNTPmix (10 mM ognuno, 200 M ognuno fin) 1.0 l Templato (cDNA genomico umano) 5.0 l Primer SODHIndIII (100 pmol/l) 1.0 l Primer SODSalI (100 pmol/l) 1.0 l Taq polimerasi* 5 U/l 0.5 l   50.0 l *Aggiungere la Taq alla fine Cicli 94 °C 5’ 94 °C 30’’ 55 °C 60’’ 30 cicli 72 °C 2’ 72 °C 10’ 15 °C O/N

  21. Purificazione prodotto PCR Il prodotto viene purificato con il QIAquick PCR purification kit (per purificazione di doppi o singoli prodotti di PCR da 100 bp a 10 kb) Il DNA si assorbe su specifiche membrane di gel di silice in presenza di alta concentrazione di sali, mentre i contaminanti passano attraverso la colonna. L’assorbimento del DNA su gel di silice dipende dal pH ed è ottimale a pH  7.5 (tampone PB). Il lavaggio viene effettuato con una soluzione contenente etanolo (PE) che lava via sali e altri contaminanti L’eluizione viene fatta in condizioni basiche, a bassa forza ionica, con 10 mM Tris pH 8.5. Bind Wash Elute

  22. Protocollo di purificazione del frammento PCR

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