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I canali ionici consistono in macromolecole singole o organizzate in complessi, che costituiscono la parete del canale - o poro – che attraversa la membrana plasmatica e connette l’interno della cellula con l’esterno. neurotrasmettitore. trasmissione chimica alle sinapsi:. aperto. chiuso.
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I canali ionici consistono in macromolecole singole o organizzate in complessi, che costituiscono la parete del canale - o poro – che attraversa la membrana plasmatica e connette l’interno della cellula con l’esterno.
neurotrasmettitore trasmissione chimica alle sinapsi: aperto chiuso trasmissione elettrica negli assoni: campo elettrico aperto chiuso In generale, i canali ionici si aprono in seguito ad un cambiamento conformazionale, che può avvenire: • in seguito all’attivazione della componente recettoriale del canale da parte di una specifica molecola messaggero (canale chemio-dipendente); • oppure in seguito ad una variazione del potenziale di membrana captata da una parte specifica del canale, il sensore del voltaggio (canali voltaggio-dipendenti).
Era noto da lungo tempo che attraverso la membrana plasmatica è possibile un rapido scambio di ioni. Tuttavia, Neher e Sakmann furono i primi a mostrare l’esistenza di canali ionici specifici La tecnica del patch clamp Erwin Neher & Bert Sakmann Premi Nobel per la medicina nel 1991 per lo sviluppo della tecnica del patch-clamp rendendo possibile la caratterizzazione di singoli canali ionici
Per chiarire come funziona un canale ionico, cioè come esso si apre e si chiude, è necessario poter registrare la corrente che lo attraversa. Antecedentemente all’era del patch-clamp ciò appariva elusivo in quanto la corrente ionica attraverso un singolo canale è molto piccola. Con la tecnica del patch-clamp si poterono superare tali difficoltà.
microelettrodo microscopio micromanipolatore preparato gabbia di Faraday Il setup per il patch-clamp computer oscilloscopio amplificatore
Amplificatore Registrazione di una corrente elettrica che fluisce attraverso un singolo canale ionico Elettrodo di registrazione: micropipetta di vetro 10-6 m Resistenza della saldatura: >1 GW Con un opportuno equipaggiamento elettronico e opportune condizioni sperimentali è possibile misurare questa corrente “microscopica” Quando un singolo canale si apre, gli ioni si muoveranno attraverso il canale come una corrente elettrica
Quale tipo di informazioni è possibile ottenere dalla registrazione di correnti di singolo canale?
0.5 pA 10 ms E’ possibile misurare l’ampiezza media della corrente che fluisce attraverso un singolo canale La distribuzione delle correnti di singolo canale è gaussiana
Quale altro tipo di informazione può dare l’analisi delle correnti di singolo canale? • Il numero degli stati in cui il canale può esistere • Il tempo medio di permanenza in ciascun stato • La probabilità che un canale ha di trovarsi in quello stato • Le velocità di transizione tra gli stati
Meccanismi potenziali di modulazione di un canale ionico Enzima effettore 2o messaggero Recettore ? canale ionico Regolazione della funzione dei canali ionici
agonista canale fosforilaz. proteina regolatrice Possibile meccanismo di regolazione di un canale mediante produzione di un 2o messaggero citoplasmatico
Recettore G proteina canale agonista canale X recettore proteina G agonista Possibile meccanismo di regolazione di un canale mediante interazione diretta con una proteina G
Recettore G proteina i q s t effettore canale enzima Certi canali K+ sono effettori di Gi/o La tecnica del patch-clamp, nelle sue varie configurazioni, ha dato un contributo fondamentale a chiarirne il meccanismo d’azione
Nella modulazione di tale canale non è coinvolto un secondo messaggero intracellulare diffusibile Utilizzo della configurazione di cell-attached per lo studio dei canali al K+ muscarinici
Amplificatore vescicola trazione esposizione all’aria Cellula Cell-attached patch Inside-out patch Inside-out patch Nella configurazione di inside-out la parte intracellulare della membrana viene a contatto con l’ambiente esterno
Recettore G proteina i q s t effettore canale enzima trasmettitore GTP L’attivazione di Gi/oporta al rilascio di Ga e Gbg n = 1 (aperto) + neurotr. n = 0 (chiuso) Certi canali K+ sono effettori di Gi/o
Recettore G proteina i q s t effettore canale enzima trasmettitore Gbg GTP no GTP Þno G* n= 0 (chiuso) Nessuna apertura del canale n = 1 (aperto) +Gbg n = 0 (chiuso) Certi canali K+ sono effettori di Gi/o La configurazione di “inside-out” permette l’accesso alla superfice interna della membrana
