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实验 140 从猪血中提取 SOD 和凝血酶

实验 140 从猪血中提取 SOD 和凝血酶. 140.1 实验目的 (1) 了解 SOD 和凝血酶的生理功能。 (2) 了解 SOD 和凝血酶的制备方法。. 140.2 实验原理 超氧化物歧化酶（ SOD ）是一种金属酶，也是一种蛋白质，可在一定浓度的酸、碱、盐溶液中溶解，又可在一定浓度的有机溶剂中沉淀，可以利用这一特点，将 SOD 从血液中提取出来，然后用柱层析进行分离以获得纯净的 SOD 产品。凝血酶也是一种蛋白质，提取方法与 SOD 类似。. 140.3 操作流程 （ 1 ）血球和血浆的分离. 柠檬酸钠. 血球. 新鲜猪血.

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实验 140 从猪血中提取 SOD 和凝血酶

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Presentation Transcript

  1. 实验140 从猪血中提取SOD和凝血酶 140.1实验目的 (1) 了解SOD和凝血酶的生理功能。 (2) 了解SOD和凝血酶的制备方法。

  2. 140.2 实验原理 超氧化物歧化酶（SOD）是一种金属酶，也是一种蛋白质，可在一定浓度的酸、碱、盐溶液中溶解，又可在一定浓度的有机溶剂中沉淀，可以利用这一特点，将SOD从血液中提取出来，然后用柱层析进行分离以获得纯净的SOD产品。凝血酶也是一种蛋白质，提取方法与SOD类似。

  3. 140.3 操作流程 （1）血球和血浆的分离 柠檬酸钠 血球 新鲜猪血 搅拌 离心 血浆

  4. （2）SOD的提取 去离子水 冷乙醇、丙酮 0.9%氯化钠液 洗涤 搅拌 搅拌 血球 静置24h 冷丙酮 静置30min 搅拌 离心 静置30min 上清液 KH2PO4-K2HPO4 离心 沉淀物 加热 恒温 冷却 离心 冷丙酮 离心 静置30 min 上清液 干燥 粗品SOD

  5. （3）SOD的纯化 粗品SOD溶于KH2PO4-K2HPO4 KH2PO4-K2HPO4 洗脱 树脂 预处理 装柱 上柱 精品SOD 超滤浓缩 冷冻干燥 透析 称量 计算产率

  6. （4）凝血酶的提取 蒸馏水 HAc调pH=5.3 0.9% NaCl液 凝血酶原沉淀 血浆 溶解 离心 溶解 冷丙酮 CaCl2 冷藏 上清液 离心 凝血酶 静置 冷丙酮 离心 沉淀 洗涤 冷藏 过滤 洗涤 凝血酶粗品 干燥

  7. （5）凝血酶的纯化 重复一次 沉淀 HAc调pH=5.5 0.9% NaCl液 过滤 滤液 离心 溶解 静置 凝血酶粗品 冷丙酮 清液 洗涤 沉淀 过滤 浸泡 干燥 精凝血酶

  8. 140.4 注意事项 (1) 分离血球和血浆温度宜在15 ℃以下。 (2) SOD和凝血酶提取过程中应避免高温，以免酶失活。

  9. 140.5 问题讨论 (1) 在提取SOD和凝血酶时,欲使这2种酶分别从血球和血浆中分离出来,能否用三氯乙酸，苦味酸或CuSO4作为沉淀剂，为什么？ (2) SOD和凝血酶能否采用烘干法（105 ℃）进行干燥？最好采用何种干燥方法？

  10. 140.6 参考答案 (1) 在提取SOD和凝血酶时,欲使这2种酶分别从血球和血浆中分离出来,能否用三氯乙酸，苦味酸或CuSO4作为沉淀剂，为什么？ 答：不能用三氯乙酸、苦味酸或硫酸铜作为沉淀剂，因为它们与蛋白质作用生成的是不可逆沉淀，改变了SOD和凝血酶结构，使之失去生理活性。

  11. (2) SOD和凝血酶能否采用烘干法（105 ℃）进行干燥？最好采用何种干燥方法？ 答：均不能采用常规的烘干方法进行干燥，因为高温易使蛋白质变性而失去活性。最好是采用冷冻干燥或低温减压干燥法干燥。

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