Ruolo degli Agenti Demetilanti in Ematologia

1. Ruolo degli Agenti Demetilanti in Ematologia

2. Metilazione del DNA e Repressione della Trascrizione Trascrizione attiva Repressione TF X POLII TF X CH3 CH3 CH3 C C C C C C MeCP DNA-non metilato DNA metilato

3. Metilazione nel genoma umano • Le “CpG islands” : 200 bp-5000 bp. Si trovano principalmente nei promotori dei geni e negli introni. • Sono normalmente non-metilate nei geni “house-keeping” • Sono metilate nei geni tessuto-specifici. La demetilazione determina il differenziamento cellulare (es: geni del differenziamento mieloide, HbF) Herman et al, NEJM, 2003

4. siRNA Rimodell TF X X CH3 CH3 CH3 C C C Silenziamento trascrizionale epigenetico DNMT1, 3a, 3b Ipermetilazione Istone metilasi DNMT HDAC MBP Silenziamento genico

5. L’ ipermetilazione globale e’ frequente nelle LMA Costello et al, Nature Genetics, 2000

6. Ipermetilazione di geni oncosoppressori L’ipermetilazione contribuisce alla trasformazione e alla progressione neoplastica mediante l’inattivazione di geni oncosoppressori L’ ipermetilazione di diversi geni si trova gia’ nelle lesioni pre-cancerose del colon, indicando il possibile ruolo dell’ipermetilazione durante la iniziazione della tumorigenesi. Elevata frequenza di ipermetilazione anche nelle MDS. Analogamente al colon, le MDS rappresentano spesso la fase pre-neoplastica delle AML • Il 68% delle t-MDS/t-AML presenta ipermetilazione di p15, che correla con la presenza di 7q-, allo stadio della t-MDS, e alla percentuale di blasti midollari (Christiansen, Leukemia 2003).

7. “The Hallmarks of Cancer” Crescita autonoma Ridotta sensibilita’ ai segnali inibitori della proliferazione Blocco dell’ Apoptosi U Cancro M  Angiogenesi Angioinvasivita’ e Metastasi Replicazione Incontrollata

8. Geni ipermetilati in Ematologia

9. Meccanismi di ipermetilazione nelle LMA Diretto: Iperespressione di DNMT1, 3a, 3b Mizuno et al, Blood 2001

10. Meccanismi di ipermetilazione nelle LMA Indiretti • AML1/Eto lega HDAC e reprime la trascrizione • (Amman et al, MCB 2001) Nella APL PML/RARa lega DNMT3a e interferisce con HDAC,bloccando l’espressione di geni “RAR-dependent” (Di Croce et al, Science 2002)

11. Geni importanti per la leucemogenesi, regolati dalla metilazione del promotore MGMT(O6-metilguanina-metiltransferasi): è un gene di riparazione del DNA che rimuove agenti alchilanti e citotossici dalla posizione 06 della guanina. DAP-chinasi: è una serin/treonina chinasi, regolata da calcio e calmodulina, con una funzione pro-apoptotica. GSTP1: e’ un gene di detossificazione. BRCA-1: e’ un gene di riparazione/ricombinazione del DNA, importante nel mantenimento dell’integrita’ genomica. E’ metilato nel 65% dei tumori ovarici e nel 10% di quelli mammari non-ereditari.

12. Methylation-Specific PCR (MSP) 100 bp DNA Ladder Unmethylated Methylated

13. 100 80 60 40 20 0 DAP- MGMT BRCA-1 GSTP1 KINASI Frequenza di ipermetilazione nelle LMA (n=150) Unmethylated Methylated

14. Ipermetilazione e leucemie therapy - related 13/17 Therapy Therapy - - related related 80 80 De novo De novo 60 60 15/30 50/100 40 40 7/25 40/154 18/111 4/25 20 20 4/111 0 0 DAP - K MGMT BRCA - 1 GSTP - 1 p= 0.01 P= 0.04 p= 0.06 p= 0.2 OR 2.8 (1.3-6.3) OR 5 (1.2-22)

15. Ipermetilazione e Prognosi T-MDS Overall Survival Christiansen et al, Leukemia 2003

16. Leucemia linfoblastica acuta Roman-Gomez-J, n=251 pts, Blood 2004

17. ALL DFS OS Roman-Gomez-J, n=251 pts, Blood 2004

18. MGMT e Prognosi: 84 pts con B-DLCL Esteller et al, JNCI 2001

19. DNMT1, 3a, 3b Rimodell DNMT HDAC MBP Agenti demetilanti Demetilanti: Azacitidina, Decitabina, Pseudoisocitidina, 5-Fluorodeoxicitidina,Zebularina, Procainamide (?) Inibitori dell’ Istone Deacetilasi: Acido Valproico, sodio-fenil-butirato, Tricostatina,Depsipeptide TF CH3 CH3 CH3 C C C Trascrizione attiva

20. Meccanismo di azione dell’Azacitidina Herman et al, NEJM, 2003

21. 5 4 3 3 2 2 1 Dec 1μM 1 0 0 0 1 4 t=0 1 2 3 4 Treatment of Jurkat cell line Decitabina Azacitidina 10 Ac.Ac Ac.Ac Tc Tc Cells (106/ml) Aza 0,5μM Aza 1μM Days of culture

22. 1 1 1 2 2 2 3 3 3 5 aza-2’-deoxicytidine Treatment Raji cell line Demethylation MSP DAP-Kinasi 200 nM DAC 1 μM DAC mock 0 J - days Unmethylated reaction Methylated reaction

23. 0 0 1 1 2 2 3 3 4 4 - + 1 2 3 4 5 aza-2’deoxicytidine Treatment Raji cell line Expression 200 nM DAC mock 1 μM DAC days DAP-KINASE M GAPDH

24. Day 0 12 4.5% Aza 1μM 8 Ac.Ac 4 Tc 0 1 4 Day 0 Demethylation of DAP-KINASE and Apoptosis (HL-60 cells) % Day 4 2.3% 14% Aza Ac.Ac

25. 5-azacytidine Treatment N= 191 pz with MDS 75 mg/m2 per 7 gg, ogni 28 gg At 4 months: Aza 60% response CR 7% PR 16% Improved 37% Supp. Care 5% improved N=37 pz no CR/PR Silverman et al, JCO 2002

26. Time to AML transformation or Death N=191 MDS pz OS in relazione all’IPSS Leucopenia grado 3-4: 59% Neutropenia: 81% Trombocitopenia 70% Infezioni 20% Nausea e vomito 4% Median Time to Progression Aza : 21 mesi Supp. Care: 12 mesi Silverman et al, JCO 2002

27. PLTs dopo 1 ciclo Decitabine Treatment N=162 pz IPSS>Intermedio 1 PLTs stabili PLTs Van den Bosch et al, Leukemia 2004

28. Decitabine – Escalating doses N=48, 35 AML, 7 MDS, 5 CML, 1 ALL Non-hematological side-effects Issa et al, Blood 2004

29. Decitabine – Bu/Cy for BMT (N = 43 pz) Overall Survival Decitabine 400 mg/m2 600 800 Days -10 e -11 De Lima et al, Cancer 2003

30. Rischi della demetilazione Attivazione di proto-oncogeni Instabilita’ cromosomica Mutazioni • Topi con ridotta DNMT1 presentano “ipometilazione” diffusa con ridotta stabilita’ genomica e presentano un’elevata incidenza di linfomi T (Gaudet et al, Science 2003) • La sindrome ICF (immunodeficit, instabilita’ dei centromeri e anomalie faciali) e’ dovuta a una mutazione della DNMT3B e si caratterizza per una diffusa ipometilazione del DNA satellite. Incidenza di tumori non aumentata. • La demetilazione farmacologica e’ transiente e reversibile entro 2 settimane (Yang AS, Science 2003)