第九章 遗传重组

1. 第九章 遗传重组

2. 第一节 概述 • 第二节 同源性重组 • 第三节 大肠杆菌重组的分子基础 • 第四节 DNA的拓扑学 • 第五节 位点特异性重组 • 第六节 异常重组

3. 遗传物质的变异包括： • 突变，基因或染色体的结构发生改变； • 重组，基因染色体的序列发生重排及新的组合。 • 基因重组是指由于不同DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合，形成新的DNA分子的过程。

5. 重组的类型： （1）同源重组 (homologous recombination )或普遍性重组（generalized recombination ）： • 大片段同源DNA序列之间的交换。 • 交互重组：发生在真核生物减数分减过程中； • 单向重组：发生在细菌中转化、接合和广泛性转导中的，即仅使受体发生重组，供体并未发生改变。 • 其主要特点是需要RecA蛋白的介入。

6. （2）位点特异性重组（site-specific recombination）： • 重组发生在特殊位点上，此位点含有短的同源序列，供重组蛋白识别。 特点： • 发生在特异位点； • 需蛋白的催化； • 涉及交错切割。 • 最为典型的是λ噬菌体在att位点整合E.coli的基因组中。

7. （3）转座重组（transposition recombination）： • 转座的机制依赖DNA的交错剪切和复制，但不依赖于同源序列。 • 转座涉及转座酶，解离酶和DNA聚合酶， • 分为复制型、非复制几种类型。 • 转座的过程中会形成共合体。 • 两个转座因子之间的重组会引起缺失和倒位。

8. （4）异常重组： • 分为两类，末端连接和链滑动。 • 其特征是重组对中很少或没有序列同源性，所以也称为非同源性重组。

10. 第二节 同源重组

11. 1 特征 1.1同源重组（homologous recombination）: 发生在同源DNA序列之间。 1.2特征-进行同源重组的基本条件： 1） 在交换区具有相同或相似的序列：涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大；单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号 2） 双链DNA分子之间互补碱基进行配对 3） 重组酶 4） 异源双链区的形成:涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程；存在重组热点。

12. e.g. • Euk.减数分裂时的染色单体之间的交换；细菌的转化，转导，接合，噬菌体重组 细线期 合线期 • 同源重组是同源依赖性的，而非序列依赖性。所以任何两个具有同源性的DNA分子可以通过此过程进行重组。 • 同源重组有两个基本功能：遗传混合和DNA修复。 • 同源重组见于减数分裂时的染色体分配，DNA修复，转座等过程。 粗线期 双线期 终变期

13. 2 同源重组的机制 2.1断裂复合及Holliday中间体的形成 ◘ 同源重组都涉及到DNA分子内的－－断裂—复合 ◘ Holliday结构 同源重组中连接两个DNA双链的交换中间物含有4股DNA链， 在连接处为了转换配对所形成交叉链的连接点为… ◘ Holliday结构形成的分子机制（断裂复合起始机制） 有Holliday双链侵入模型、单链侵入模型、双链断裂修复模型等多种

14. 1) Holliday双链侵入模型 其中－－ 所有模型和切断、链置 换、连接等过程。

15. 3 5 5 3 2) 单链入侵模型（链转移模型） Meselson-Radding模型 Loop泡的切断 切口 3 5 吸收碎链 取代 异构化 侵入 分枝迁移

16. 3) 双链断裂修复模型

17. 2.2 分枝迁移和Holliday结构的拆分 1）分枝迁移（branch migaration） －－双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散

18. 2）Holliday的异构化 Holliday结构一经生成即可 不断地处于异构化－－异源双链 heteroduplex DNA 重组结果取决于拆分时 配对链上的切口位置 产生重组体的拆分

19. 3 1 2 4 Holliday中间体的拆分 3，4切割 1，2切割 DNA内切酶 DNA内切酶 DNA内切酶 DNA内切酶 产生含异源双链的亲本DNA分子 产生重组体

20. “重组体” “亲本链”

21. Holliday双链入侵模型全过程

23. 3 重组和联会复合体之间的关系 • 同源染色体配对时形成联会复合体（synaptonemal complex, SC） • SC是重组的结果，而不是重组的原因。 4 基因转变 • 基因转换（gene conversion）：一个基因转变为另一等位基因。 • Lindegren（1949）酵母的异离常分离：交配型A×a的杂交中，有些子囊所含的孢子为（3A+1a），也称为基因转换。 • 50年代中期Mitchell：异常分离不是由于整个染色体的异常行为，而是由于特定位点的“基因转换”所致，即属于基因内重组。 • Olive等在粪壳菌也发现了异常分离。认为这种异常分离是有丝分裂的产物，称为减数后分离（postmeiotic segreation）。

25. 第三节大肠杆菌重组的分子基础

26. 1 细菌（E.coli）转化中的重组---基因转移 1）细菌的接合作用(conjugation)  细菌的细胞相互接触时遗传信息可以由一个细胞转移到另一个细胞。 2）细菌的遗传转化(genetic transformation) 指细菌品系由于吸收了外源DNA(转化因子)而发生遗传性状的改变现象。 3）细菌的转导(transduction) 通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程。 4）细菌的细胞融合(cell fusion) －形成原生质体 • 进入受体细胞(recipient cell)的外源基因有四种结果： 降解、暂时保留、与内源基因置换和发生整合。

27. ◘ 发生在双方DNA的同源区域； 部分复制的染色体DNA之间或染色体DNA与外源DNA之间 细菌的转化、结合和转导。 2 RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和 Chi 位点 2.1 活性 ◘ 具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、 序列特异性的单链内切酶活性； ◘ 单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链 －－－RecA的作用位点； ◘ RecBCD有固定切割位点；

28. 2.2 RecBCD的作用过程 a、RecBCD结合在DNA的平 头末端（产生机制不清楚） b、 外切、解链、移动 （ATP） c、兔耳状 loop 结构产生 （再旋酶活性低于解旋酶活性） d、RecBCD 在 loop 单链区的 chi 位点3‘方4～6NT处 切断单链（单链内切酶） ☀chi位点：GCTGGTGG 目前发现的重组热点 E.coli含 1009 个、Euk.

29. e、RecBCD 切割产生3’单链末端

30. 3 RecA 蛋白 • RecA有两个主要的功能：诱发SOS反应和促进DNA单链的同化(assimilation)。 • 单链同化：即是指单链与同源双链分子发生链的交换，从而使重组过程中DNA配对、Holliday中间体的形成，分支移动等步骤得以产生。 • 3.1活性 a、 RecA 有单、双链 DNA结合活性; b、 RecA 有 NTPase 活性（底物差异活性）， 与单链 DNA 结合时活性最大---依赖于 DNA ； c、 RecA 有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子 的能力，即联会同源 DNA； （但其靶 DNA 必须有缺口－－结合DNA）。

31. RecA蛋白相对分子质量为38000，与单链DNA结合形成的螺旋纤丝每圈含六个单体。RecA蛋白相对分子质量为38000，与单链DNA结合形成的螺旋纤丝每圈含六个单体。

32. 3.2 作用过程： 1）RecA蛋白与单链DNA的结合 2）联会：单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子Holliday（5‘侵入）。 3）联会后链交换：启动双链DNA分子的一条链的替换和新链的同化。 • 交换速度大约为6 bp/s，其方向是５’→３’。 • 当新的杂交双链形成时，RecA蛋白即从原来的单链掉下来。 • RecF、RecO和RecR蛋白调节RecA纤丝的装配和拆卸。

33. RecBCD和RecA 的共同作用

34. 3.3 原核同源重组的其它蛋白 需要 E.coli 中三个基因 ruvA,ruvB 和 ruvC的产物： a、RuvA 识别 Holliday 结构的连接点； b、RuvB 为分枝迁移提供动力（ATPase 10～20bp/s）； c、RuvC 核酸内切酶---专一性识别 Holliday 结构的连接点体外切段连接点以拆分重组体。 d 、RecG解旋酶也具有解离Hollidy连接的活性，使重组得以完成。

35. ◘ E.coli 重组的各阶段 （损伤修复） 损伤DNA复制产生缺口 RecA链交换 第二次链交换 DNApol通过DNA合成填满缺口 RuvA,B分枝迁移 RuvC切割Holliday连接点

36. 第四节位点特异性重组

37. 1 位点特异性重组（site-specific recombination） 1.1 概念：发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间的重组。 噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组。 1.2 特征： ◘ 在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接 ----产生精确的DNA重排； ◘ 都具有整合作用的两个基本特征： a、典型的保守性重组---交换是相互的和保存原先的DNA b、发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列的特异性核苷酸上 Euk. 中专一性抗体基因的构建。

38. 2 λDNA的整合与切除 2.1 实现机制： 均是通过---细菌DNA和λDNA上特定位点之间的重组。 2.2 特定位点-----附着位点（attachment site att） ◘ E.coli attB含BOB’三序列 23bp ◘ λDNA attP含 POP’三序列 240bp ◘ 核心序列 “O”完全一致 15bp （同源部分） ---位点特异性重组发生的地方 ◘ B,B’,P,P’---臂

39. 2.3 整合和切离过程 ◘ 整合后的附着位点为 attL（BOP’） attR（POB’） ◘ 整合位点---attB、attP 切除位点---attL、attR • ◘依赖蛋白: • 整合过程需要λ整合酶（integrase Int）（λ编码）和寄主的整合宿主因子IHF（integration host factor）共同作用。 • 切离反应需要噬菌体Xis基因的产物以及Int和IHF。

40. 1) 整合酶(integrase) λ噬菌体int基因编码 功能：识别POP’和BOB’ 结合 与POP’结合 拓扑异构酶I活性 2)整合宿主因子（IHF)（integration host factor） 细菌基因编码 功能：促进整合酶与POP’和BOB’结合。 3)切除酶（excisonase） λ噬菌体xis基因编码 功能：与整合酶结合后识别POB’和BOP’,切割O序列，重新形成POP’和BOB’。 4)逆转刺激因子（FIS） 功能：参与切除过程。

41. 溶菌周期 （lysis） 溶源性细菌 (lysogen) 原噬菌体

42. 2.4 整合分子机制 ◘ 核心序列O全长15bp，富含A-T ◘ 发生在O内的重组交换位点相距 7bp。 ◘ attP位点的负超螺旋为重组所必须---加强了Int和IHF的亲和力 -----高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构。 ◘ 整合酶的结合位点：attP 240bp、attB 23bp(两者的作用不同)。 ◘ Int结合： ----核心序列的反向位点（切割位置） ----结合在att臂上（臂与核心区靠近）

44. attB和attP的最初识别靠Int识别两序列的能力； • 两序列的同源性在链交换时为重要因素。 • Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，近而使holliday结构拆分； • 重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交。

46. 第六节 异常重组 异常重组（ Illegitimate recombination）： • 无同源序列的两个DNA分子之间的交换。 • 形成重组分子时往往依赖于DNA的复制而完成重组过程。 • 这种类型的重组也不需要RecA蛋白的参与。

47. 复习题 名词解释 遗传重组 同源重组 位点专一性重组 Holliday 结构 • 问答题 • 遗传重组有几种重要的形式？ • 同源重组的简单过程及Holliday结构形成的分子机制。 • 细菌同源重组涉及的主要酶系及各自在重组中的功能为何。 • λDNA的整合与切除的分子机制（重组涉及的各要素及简单过程）。 • 位点特异性重组有需要短的同源顺序，此与同源重组有何不同？

48. λ-DNA的整合和切除 1，附着点（att位点）： attB 大肠杆菌附着点，含B,O,B’三种序列 attP λ-DNA附着点，含P,O,P’三种序列 2, 核心序列（O序列）： 15bp,在 attB和attP中完全相同 -GCTTTTTTATACTAA- -CGAAAAAATATGATT- 3，B，B’，P，P’的长短和核苷酸序列均不相同