氨基酸纸层析

氨基酸纸层析

氨基酸纸层析是氨基酸分离鉴定的一种简单方式。氨基酸纸层析是氨基酸分离鉴定的一种简单方式。 • 是为了测定蛋白质的氨基酸组成或从蛋白质水解液中制取氨基酸，需要对氨基酸混合物进行分离。

一、实验目的 • 1、通过实验，了解氨基酸纸层析法的原理。 • 2、掌握氨基酸纸层析的操作方法

二、实验原理 • 层析：又称色谱（chromatography） • 层析系统常常由2个相组成：固定相（静相）和流动相（动相）。混合物在层析系统的分离决定于该混合物的组分在这两相中的分配系数。

一种溶质在两种给定的互不相容的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值。 • 分配系数

纸层析 • 用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法。 • 纸层析所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成。滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。

将样品点在滤纸上（此点称为原点），进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点不等的层析点将样品点在滤纸上（此点称为原点），进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点不等的层析点

溶剂由下向上移动的，称为上行法；由上向下移动的，称下行法。 当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90°再用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向纸法。氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。 • 方向、显色

Ｒf溶质在滤纸上的移动速率用值来表示： 展层层斑点中心与原点间的距离 Rf = -------------------------------------------- 溶剂前沿与原点之间的距离

三、试剂和仪器 • 试剂茚三酮、丙酮、冰醋酸、正丁醇、标准氨基酸混合溶液：异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸 • 器材层析缸；培养皿15cm（×2）；喷雾器；毛细管内径0.1cm；电吹风；烘箱。层析滤纸12×12cm；铅笔，尺，针、线。

四、实验步骤 • 1、层析纸准备滤纸裁成10×8.5cm长方形，在距纸一端1.5－2cm处划一直线，并在此端做记号。在线上每隔一定距离画一小点作点样的原点，共5个点（5个样品）。（注意：戴手套，不能用手直接接触）

2、点样 氨基酸点样量以每种氨基酸含５－２０μl为宜。用毛细吸管，吸取氨基酸样品点于原点（分批点完，点3－4次，干了后才能点下一次），点子直径不能超过0.5cm。

3.展层 • 将点好样的滤纸卷制成圆筒，注意滤纸两边不能接触； • 把展层剂（正丁醇︰80%甲酸︰水=15︰3︰2）倒入烧杯内（约1cm高）；（用完后回收） • 将滤纸放入烧杯中（画线端向下），注意滤纸勿与杯壁接触。进行展层。

4.烘干、显色 • 当溶剂展层至距滤纸上沿1～２cm时（约要40分钟），取出滤纸，作好前沿位置标记后烘箱烘干（1分钟）。 • 向滤纸上喷显色液至显色，烘箱烘干（3－4分钟）。

5.计算 • 求出各氨基酸的Rf值， • 将各显色斑点的Rf值与标准氨基酸的Rf值比较，可得知该斑点的准确成分 • 得出结果

注意事项 • （1）烘箱加热温度不可过高，且不可有氨的干扰，否则图谱背景会泛红。 • （2）整个实验操作应戴手套进行。

思考题: • 1．酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响？ • 2．选用两种溶剂系统进行层析时应注意什么问题？ • 3.实验中Ala，Tyr，Try，Phe，Arg的迁移率之间的差别可以说明什么问题？

谢谢！

氨基酸纸层析

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