Protein-Protein Bindungsstellen

1. Protein-Protein Bindungsstellen Lennart Heinzerling

2. Worum geht es in den nächsten 45 Minuten? • Auffinden von Protein-Protein Komplexen aus einer großen Menge potentieller Komplexe z.B. für -Interaction Networks -funktionelle/räumliche Zuordnung neuer Proteine durch neue Erkenntnisse über Bindungsstellen • Bisher Docking mit bekannten 3D Strukturen zum Auffinden von Komplexen. Nun: Proteinsequenzen  Proteinkomplexe

3. Sequenz  Komplex? • Kann man aus der Sequenz eines Proteins genug Informationen ziehen um Bindungsstellen und Komplexe zu finden? • Wir werden sehen: ja!

4. Verschiedene Methoden, verschiedene Einsatzgebiete • In Silicio two Hybrid • Korrelierte Mutationen • Strukturelle Konservierung

5. Erste Methode • Korrelierte Mutationen und Bindungsstellen

6. Zeigen korrelierte Mutationen Bindungsstellen auf? • An Interaktionsstellen muss zwangsläufig Koevolution statt finden • Sind korrelierte Mutationen eindeutig mit Bindungsstellen verknüpft? • Methode kann zur Unterstützung des Dockings eingesetzt werden oder zur Voraussage der Bindungsstelle aus der Sequenz

7. Methode zum Auffinden korrelierter Mutationen • Alignment der Sequenzen wird erstellt • Korrelation wird für jede Position berechnet • Die n am besten korrelierten Mutationen werden als Bindungsstellen – AS betrachtet • Xd Wert: Maß für den Anteil korrelierter Reste bei kleinem Abstand. Je höher desto besser Pazos, Helmer-Citterich, Ausiello, Valencia, J.Mol.Bio 271(1997)

8. Testmenge • Die Methode wurde hauptsächlich an inter-domain Kontakten getestet • Test der Methode an zwei großen Mengen von Docking-Lösungen • Zum Zeitpunkt der Untersuchung stand keine ausreichende Menge von Komplexen zur Verfügung • „Echte“ Komplex-Tests daher nur an Hämoglobin und Hsc70

9. Sind sich korreliert mutierte AS näher? • Untersuchung der 21 zweidomänigen Proteine ergab eine klare Tendenz korrelierter Mutationen, sich räumlich nahe zu sein • Dies deutet darauf hin, dass korrelierte Mutationen Bindungsstellen aufzeigen können Pazos, Helmer-Citterich, Ausiello, Valencia, J.Mol.Bio 271(1997)

10. Sind sich korrelierte AS unabhängig von Domänenstellung nahe? • Untersuchung an der geöffneten (3cln) und geschlossenen(2bbm) Form von Calmodulin • Eindeutig größere Nähe der korrelierten AS bei geschlossener Form • Ergebnis unterstreicht die Signifikanz von korrelierten AS als Indikator für Bindungsstellen Pazos, Helmer-Citterich, Ausiello, Valencia, J.Mol.Bio 271(1997)

11. Anwendung: Unterstützung des Dockings • 7440 mögliche Docking – Lösungen wurden für Proteine 2c2c und 3est generiert • Die optimale Lösung hat einen Xd-Wert, der unter den besten 5% liegt • Andere Lösungen mit hohem Xd-Wertsind der optimalen Lösung nahe Pazos, Helmer-Citterich, Ausiello, Valencia, J.Mol.Bio 271(1997)

12. Gute Resultate mit einem Hetero-Dimer? • Bisher nur Tests an Kontakten zwischen Domänen • Zum Zeitpunkt der Untersuchung gab es keine ausreichende Datenmenge von PP – Komplexen A1-b1 Monomere desHämoglobin als Testproteine Mehrere Docking-Lösungen werden generiert Der Xd Wert der optimale Lösung liegt in der Menge der 6% größten Xd-Werte Pazos, Helmer-Citterich, Ausiello, Valencia, J.Mol.Bio 271(1997)

13. Bindungsstellenvorhersage aus der Sequenz allein? • Test am zwei-Domänen-Protein Hsc70 • Domäne Nt – Struktur bekannt, Domäne Ct Struktur unbekannt • Ergebnisse deuten auf eine eindeutige Docking-Lösung hin, wurden jedoch nicht validiert Pazos, Helmer-Citterich, Ausiello, Valencia, J.Mol.Bio 271(1997)

14. Zusammenfassung korrelierte Mutationen • Korreliert mutierte Aminosäuren deuten auf Bindungsstellen hin • Die Auswahl der optimalen Docking-Lösung wird durch die Methode vereinfacht • Anwendbarkeit außerhalb dieser Hilfsfunktion nicht hinreichend validiert, Testreihen zu klein

15. Nächste Methode • In Silicio two Hybrid

16. In Silicio Two Hybrid • Methode zum Auffinden neuer Proteinkomplexe und ihrer Interaktionsstellen • Benötigt werden nur Sequenzen, keine 3D Strukturen

17. iS2H: So funktioniert es A: Alignment zweier Protein 1 und 2 mit mindestens 11 homologen Proteinen a,b,c... B: Für alle Proteine: Konkatenation des Alignments. Danach Berechnung der Korrelation zwischen den Spalten C: Verteilung der Korrelationsstärken innerhalb der Proteinen(P11,P22) und zwischen Proteinen(P12). Eingeteilt in 10 Korrelationsklassen Pazos, Valencia, PROTEINS 47(2002)

18. iS2H: Anwendung auf Testmengen • Tests an verschiedenen Mengen bekannter Proteinkomplexe lieferten positive Resultate • Daher dürfte Anwendung auf 67.238 potentielle Paare in E.Coli neue Erkenntnisse bringen

19. iS2H gegen 67.238 mögliche E.Coli PP – Paare. Ergebnisse: Pazos, Valencia, PROTEINS 47(2002) Interaction Index Scores für die Suche in 67.238 potentiellen E.Coli Protein Paaren Mögliche Interaktionen des hypothetischen Proteins YABK_ECOLI

20. iS2H Zusammenfassung • Methode zum Auffinden neuer Proteinkomplexe und deren Bindungsstellen • Tests deuten auf gute Anwendbarkeit als Indikator für Interaktionen hin. Ergebnisse müssen verifiziert werden • Ergebnisse komplementär zu Untersuchungen von Genfusionen  Methoden ergänzen sich

21. Nächste Methode • Strukturell konservierte Aminosäurenund Bindungsstellen

22. Strukturell konservierte AS und Bindungsstellen • Betrachte bekannte Proteinoberflächen: Unterscheiden strukturell konservierte AS zwischen Oberfläche und Bindungsstellen? • Ziel: Z.B. - Erleichterte Vorhersage von Protein- Protein Interaktionen - Erleichtertes Drug Design durch Erkennen der Bindungsstelle am Target oder Design der Bindungsstelle als Pharmakophor

23. Auf der Suche nach strukturell konservierten Resten • Zu Grunde liegender Datensatz von 1629 Proteinen mit bekannter Schnittstelle aus der PDB wird in 10 Familien eingeteilt • Einteilung erfolgt nach Ähnlichkeit der Sequenzen • Danach Multiples Strukturelles Alignment innerhalb der Familien Ma, Elkayam, Wolfson, Nussinov, PNAS 100(2003)

24. Multiples Strukturelles Alignment - MUSTA • Alignment der Koordinaten der C-alpha Atome • Es werden Koordinaten als Ausgangspunkte gewählt, die einander nahe sind • Rotation und Translationen werden berechnet und bewertet

25. Ergebnisse: An Bindungsstellen bevorzugte AS • Trp weist hohen Konservierungsgrad an Bindungsstellen auf. • Weniger Eindeutig: Methionin, Phenylalanin Allgemein: Hydrophobe Reste dominieren Ma, Elkayam, Wolfson, Nussinov, PNAS 100(2003)

26. Warum Trp, Met, Phe? • Trp ist besonders groß -> hydrophobe WW stark • Trp formt mit Ala Vertiefungen in der Struktur • Phe und Trp stabilisieren evtl. polare Bindungen und damit die Komplexe • Methionin: Rolle unbekannt

27. Energetische Hot-Spots • Die freie Bindungsenergie an Bindungsstellen ist nicht gleichverteilt. Es gibt Punkte hoher Bindungsenergie, die zumeist polar sind Ma, Elkayam, Wolfson, Nussinov, PNAS 100(2003)

28. Sind Hot-Spots konserviert? • Zwischen den konservierten ASund den bekannten Hot-Spots besteht eine hohe Korrelation • Unterstreicht wichtige Rolle der Hot-Spots und die Signifikanz der Anwesenheit strukturell konservierter Reste Ma, Elkayam, Wolfson, Nussinov, PNAS 100(2003)

29. Was, wenn nicht genügend Strukturen bekannt sind? • Bisher: Strukturelles Alignment(MUSTA)identifikation struktureller Konservierungen • Nur eine Struktur bekannt und mehrere homologe Sequenzen  hybrides Alignment: Zuordnung der Sequenzen auf die Struktur Ma, Elkayam, Wolfson, Nussinov, PNAS 100(2003)

30. Zusammenfassung: Strukturell konservierte Reste • Durch Alignment werden strukturell konservierte Reste aufgedeckt • Energetisch hochwertige Bindungsteile sind stark konserviert • Bestimmte AS deuten auf Bindungsstelle hin

31. Gesamtzusammenfassung • Aus Struktur, Konservierung und Sequenz lassen sich Informationen bzgl. Bindungsstellen ziehen • Voraussage von Bindungsstellen ist auch ohne 3D Struktur möglich • iS2H: Vielversprechend beim Auffinden neuer Proteinkomplexe • Korrelierte Mutationen: Als Unterstützung des Dockings gut geeignet • Strukturell konservierte Reste: Beim Drug Design oder zur Identifizierung der Bindungsstellen in einem Komplex