Основы иммунологии Вершинина В.И.

1. Основы иммунологииВершинина В.И. Лекция 16. Иммунный статус человека

2. Клиническая иммунология — раздел клинической медицины, изучающий патогенез, диагностику, лечение и профилактику заболеваний, в основе которых лежат расстройства функций иммунной системы или состояния, обусловившие выраженные нарушения иммунной реактивности, требующие особого лечения (коррекции). Становление клинической иммунологии как самостоятельной дисциплины сегодня определяется целым рядом факторов, но наиболее значимые из них следующие: Сформировалось понятие об иммунной системе с определенными ее уровнями: центральные и периферические органы, циркулирующие и локализованные клеточные элементы, целый спектр растворимых молекул антитела, цитокины, комплемент и другие. Согласно современным представлениям иммунная система выполняет не только уникальную функцию иммунитета, но выступает в роли одной из наиболее интеграционных систем в организме и обеспечивает через цитокины связь между нервной и эндокринной системами(нейроиммунология). 2. Выявлены заболевания, в основе которых лежат нарушения в иммунной системе: недостаточность функционирования (иммунодефициты), избыточное реагирование на различные компоненты (аутоиммунные, аллергические заболевания), малигнизация (лимфолейкозы), инфицирование (СПИД и другие). 3. Новые возможности оценки иммунной системы человека (определение фенотипа лимфоцитов, использование моноклональных антител, полимеразной цепной реакции, иммуноблоттинга, иммуноферментных и других методов). 4. Поиск и разработка новых лекарственных средств и методов целенаправленного воздействия на иммунную систему (иммуномодуляторы, экстракорпоральная иммунокоррекция, генная терапия и другие). 5. Рост новых наиболее опасных для человека заболеваний. В последние годы  СПИД и другие вирусные заболевания. В перспективе - заболевания, вызванные иммунотоксическим действием экологически неблагоприятных факторов внешней среды (аллергические,аутоиммунные заболевания и другие).

3. Понятие об иммунном статусе • Иммунный статус – совокупность количественных и функциональных показателей, отражающих состояние иммунной системы человека в данный момент времени. • Изучение показателей иммунитета при иммунных нарушениях должно включать исследования количества и функциональной активности основных компонентов иммунной системы. • Все нарушения функции иммунной системы классифицируют, исходя из проявлений различных заболеваний: выделяют первичные и вторичные иммунодефициты, аутоиммунные, аллергические и лимфопролифера-тивныезаболевания. Достаточно полная оценка иммунной системы необходима : • для определения состояния здоровья; • диагностики иммунопатологии; • контроля эффективности иммунотерапии (иммуносупрессия, иммуномодуляция и т.д.); • оценки иммунотропногодействия разнообразных лекарственных средств, • действия на иммунную систему различных повреждающих факторов. • Рациональным считается исследование иммунного статуса в несколько этапов: ориентировочные исследования для выявления значительных дефектов иммунной системы (1 уровень), проводят более подробное изучение (2 уровень) основываясь на данных предыдущего исследования. • Набор полученных показателей при иммунологическом обследовании называется иммунограммой.

4. Оценка иммунного статуса • Тесты 1-го уровня: Исследование фагоцитарной функции: • подсчет абсолютного числа фагоцитов (нейтрофилов и моноцитов); • оценка интенсивности поглощения микробов фагоцитами; • способности фагоцитирующих клеток переваривать захваченные микробы. • Исследование системы комплемента: • определение гемолитической активности комплемента CH50. • Исследование Т-системы иммунитета: • подсчет общего числа лимфоцитов; • подсчет процента и абсолютного числа зрелых T-лимфоцитов (CD3) и двух основных их субпопуляций: хелперов/индукторов (CD4) и киллеров/супрессоров (CD8); • определение пролиферативного ответа на основные T-митогены (ФГА и конканавалин A). • Исследование В-системы иммунитета: • определение концентрации иммуноглобулинов различных классов (G, A, M, E) в сыворотке крови; • определение процента и абсолютного количества B-лимфоцитов (CD19, СD20) в периферической крови. • Тесты 2-го уровня: • Исследование фагоцитарной функции: • оценка интенсивности хемотаксиса фагоцитов; • определение экспрессии молекул адгезии (CD11a, CD11b, CD11c, CD18) на мембране нейтрофилов. • Исследование Т-системы иммунитета: • исследование продукции цитокинов (ИЛ-2 , ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, INF-γ, TNF-α) ; • определение активационных молекул на поверхностной мембране T-лимфоцитов (CD25, HLA-DR); • выявление молекул адгезии (CD11a, CD18); • исследование пролиферативного ответа на специфическиеАГ, чаще всего на дифтерийный и столбнячный анатоксины; • проведение аллергической реакции с помощью кожных тестов с рядом микробных антигенов. • Исследование В-системы иммунитета: • Определение Ig, особенно IgG; • секреторного IgA; • исследование соотношения κ и λ цепей Ig; • определение специфических АТ к белковым и полисахаридным антигенам; • исследование способности Лф к пролиферативному ответу на B- (стафилококк, липополисахаридэнтеробактерий) и T-B- (митогенлаконоса) митогены.

5. Иммунологическое обследование человека назначается: • Рецидивирующие инфекции, инфекционные заболевания с хроническим и затяжным течением • Подозрение на генетически обусловленный или приобретенный иммунодефицит • Аутоиммунные заболевания • Аллергические заболевания • Подозрение на синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) • Онкологические заболевания • Обследование реципиентов до и после трансплантации органов • Обследование пациентов перед серьезными оперативными вмешательствами • Осложненное течение послеоперационного периода • Контроль терапии цитостатиками, иммуно-депрессантами и -модуляторами

6. Иммунологические показатели человека

8. Лейкоцитарная формула периферической крови здорового человека

9. Общее (абсолютное) и относительное число лимфоцитов определяют по данным клинического анализа крови Подсчет форменных элементов крови • Определение количества эритроцитов и лейкоцитов в 1 мм3 крови производят в счетных камерах (Тома, Горяева и др.). • Другие форменные элементы подсчитывают в фиксированных мазках крови, окрашенных по Романовскому – Гимзе: ядра лейкоцитов окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, протоплазма лимфоцитов — в небесно-голубой, зернистость эозинофилов — в интенсивно-красный, гранулы базофилов — в темный, зернистость и протоплазма нейтрофилов — в розовый. • Содержание Т- и В- лимфоцитов подсчитывают в реакции иммунофлюоресценции, используя меченные красителями моноклональныеАТ к специфическим поверхностным антигенным маркерам, обозначаемым символами CD. Так, например: • CD3 - все Т-лимфоциты, • CD19, 20, 21, 72 - В-лимфоциты, • CD4 - Т-хелперы, • CD8 - Т-супрессоры , • CD16- натуральные киллеры(NK- клетки)

10. Дифференцировочные антигены лимфоцитов человека • (CD-маркеры)

11. Продолжение таблицы

12. Принцип метода: Принцип проточной цитометрии состоит в оптическом анализе клеток или их частей в гидродинамически узконаправленном потоке, который  пересекает сфокусированный лазерный пучок.  При этом возможен одновременный мультипараметрический анализ физических и/или химических особенностей до тысячи частиц в секунду событий. Оптические сигналы  фиксируются системой фотоумножителей и зеркал. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:   •рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток). • рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток). • интенсивность флуоресцентных сигналов (возможно нескольких флуоресцентных красителей) • поляризацию флуоресценции и время пролета частицы. Эти показатели позволяют оценить  степень вязкости мембран клеток, которая меняется в зависимости от их функционального состояния, и степень асимметричности клеток или исследуемых

13. Принцип метода Принцип проточной цитометрии состоит в оптическом анализе клеток или их частей в гидродинамически узконаправленном потоке, который  пересекает сфокусированный лазерный пучок.   При этом возможен одновременный мультипараметрический анализ физических и/или химических особенностей до тысячи частиц в секунду событий. Оптические сигналы  фиксируются системой фотоумножителей и зеркал. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:   • рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток). • рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток). • интенсивность флуоресцентных сигналов (возможно нескольких флуоресцентных красителей) • поляризацию флуоресценции и время пролета частицы. Эти показатели позволяют оценить  степень вязкости мембран клеток, которая меняется в зависимости от их функционального состояния, и степень асимметричности клеток или исследуемых

14. Проточная цитометрия заняла прочные позиции в различных областях применения: • клинических: иммунология, онкология, онкогематология(включая диагностику, оценку эффективности лечения, мониторинг пациентов, входящих в группу риска),трансплантология, общая гематология, диагностическое типирование клеток и др.; • исследовательских: клеточная кинетика, клеточная энзимология, изучение механизмов действия различных иммуномодуляторов и других биологически активных веществ, клеточная физиология, генетика и др.   • Постоянно увеличивается возможности анализа различных параметров клеток, их морфологии, клеточного цикла, функциональные возможности по автоматизации и ускорению анализа. • Основной задачей проточной цитометрии в иммунологии является иммунофенотипирование нормальных и патологических ИК-клеток.

15. Одной из задач клинической иммунологии является оценка иммунного статуса, которая включает: • иммунофенотипированиелимфоцитов; • функциональнальную активность лимфоцитов; • оценку гуморального иммунитета; • активность фагоцитоза; • активность системы комплемента; • оценку интерферонового статуса

16.   В минимальное иммунологическое обследование входит : • определение общих Т-лимфоцитов (маркер CD3); • Т-хелперов/индукторов (CD4); • Т-цитотоксических лимфоцитов (CD8); • В-лимфоцитов (CD19, CD20 и CD22); • натуральных киллеров (СD16, CD56 и СD57). • Анализируя картину поверхностных дифференцировочных маркеров, можно определить популяцию и субпопуляцию клеток, стадию их дифференцировки и активации; функцию клеток и их взаимодействие с другими клетками

17. В рамках иммунограммы изучают также следующие показатели гуморального иммунитета : IgA– антитела, отвечающие за защиту слизистых оболочек; IgE– АТ ,участвующие в аллергических реакциях и защите от паразитарных инфекций; IgG– АТ вторичного ИО (обнаружение свидетельствует о микробоносительстве ) IgM– АТ первичного ИО, значение IgMважно при диагностике аутоиммунных заболеваний; аллоиммунные антитела – вырабатываются на резус-фактор или другие антигены Еr; антинуклеарные антитела – комплекс АТ, вырабатываемых в результате нарушения аутотолерантности при аутоиммунных патологиях; АСЛО (антистрептолизин-О) – показатель инфицирования организма стрептококком; антиспермальные антитела (Mar-тест) – специфические белки к антигенам мембраны сперматозоидов, исследуются в рамках теста при определении причин бесплодия; АТ-ТГ (АТ к тиреоглобулину) – белок, образующийся в клетках щитовидной железы; АТ-ТПО (АТ к тиреоиднойпероксидазе) – показатель исследуют в рамках теста для диагностирования аутоиммунных патологий щитовидной железы; HLA-типирование 2 класса (МНСII)– комплекс антигенов гистосовместимости (для оценки совместимости органов и тканей); ЦИК (циркулирующие иммунные комплексы) – образуются при контакте растворимых АГ и АТ в крови; определяются при аллергии и аутоиммунных заболеваниях.

18. Интерпретация результатов иммунограммы Т-лимфоциты (CD3+ клетки) Повышенное количество свидетельствует о гиперактивности иммунитета, наблюдается при острых и хронических лимфолейкозах. Увеличение относительного показателя встречается при некоторых вырусных и бактериальных инфекциях в начале заболевания, обострениях хронических заболеваний. Снижение абсолютного количества Т-лимфоцитов свидетельствует о недостаточности клеточного иммунитета, а именно о недостаточности клеточно-эффекторного звена иммунитета. Выявляется при воспалениях разнообразной этиологии, злокачественных новообразованиях, после травмы, операций, инфаркта, при курении, приеме цитостатиков. Повышение их числа в динамике заболевания – клинически благоприятный признак. В-лимфоциты (CD19+ клетки) Снижениенаблюдается при физиологических и врожденных гипогаммаглобулинемиях и агаммаглобулинемиях, при новообразованиях иммунной системы, лечении иммунодепрессантами, острой вирусной и хронической бактериальной инфекциях, состоянии после удаления селезенки. Увеличение отмечается при аутоиммунных заболеваниях, хронических заболеваниях печени, циррозе, муковисцедозе, бронхиальной астме, паразитарных и грибковых инфекциях. Характерно в период реконвалесценции после перенесенных острых и хронических вирусных и бактериальных инфекций. Выраженное увеличение наблюдается при хроническом В-лимфолейкозе.

19. NK-лимфоциты с фенотипом CD3-CD16+CD56+ Натуральные киллеры (NK-клетки) – популяция больших гранулярных лимфоцитов. Они способны лизировать клетки-мишени, инфицированные вирусами и другими внутриклеточными антигенами, опухолевые клетки, а также другие клетки аллогенного и ксеногенного происхождения. Увеличение количества NK-клеток связано с активацией антитрансплантационного иммунитета, в некоторых случаях отмечается при бронхиальной астме, встречается при вирусных заболеваниях, повышается при злокачественных новообразованиях и лейкозах, в периоде реконвалесценции. Снижение наблюдается при врожденных иммунодефицитах, паразитарных инфекциях, аутоиммунных заболеваниях, облучении, лечении цитостатиками и кортикостероидами, стрессе, дефиците цинка. Т-лимфоциты хелперы с фенотипом CD3+CD4+ Увеличение абсолютного и относительного количества наблюдается при аутоиммунных заболеваниях, может быть при аллергических реакциях, некоторых инфекционных заболеваниях. Это увеличение свидетельствует о стимуляции иммунной системы на антиген и служит подтверждением гиперреактивных синдромов. Снижение абсолютного и относительного количества Т-клеток свидетельствует о гипореактивном синдроме с нарушением регуляторного звена иммунитета, является патогномичным признаком для ВИЧ-инфекции; встречается при хронических заболеваниях (бронхитах, пневмониях и т.д.), солидных опухолях. Т-цитотоксические лимфоциты с фенотипом CD3+ CD8+ Повышениевыявляется практически при всех хронических инфекциях, вирусных, бактериальных, протозойных инфекциях. Является характерным для ВИЧ-инфекции. Снижение наблюдается при вирусных гепатитах, герпесе, аутоиммунных заболеваниях.

20. Для дополнительного исследования и выявления изменений иммунной системы при патологиях, требующих оценки наличия острого или хронического воспалительного процесса и степени его активности, рекомендуется включать подсчет количества активированных Т-лимфоцитов. Исследование ранних и поздних маркеров активации Т-лимфоцитов (CD3+CD25+, CD3-CD56+, CD95, CD8+CD38+) дополнительно назначают для оценки изменений ИС при острых и хронических заболеваниях, для диагностики, прогноза, мониторинга течения заболевания и проводимой терапии. Рецептор CD95+ – один из рецепторов апоптоза. Апоптоз– сложный биологический процесс, необходимый для удаления из организма поврежденных, старых и инфицированных клеток. Рецептор CD95 экспрессируется на всех клетках иммунной системы. Он играет важную роль в контроле функционирования иммунной системы, так как является одним из рецепторов апоптоза. Его экспрессия на клетках определяет готовность клеток к апоптозу. Снижение доли CD95+-лимфоцитов в крови пациентов свидетельствует о нарушении эффективности последнего этапа выбраковки дефектных и инфицированных собственных клеток, что может привести к рецидиву заболевания, хронизации патологического процесса, развитию аутоиммунных заболеваний и повышению вероятности опухолевой трансформации (к примеру, рака шейки матки при папилломотозной инфекции). Определение экспрессии CD95 имеет прогностическое значение при миело- и лимфопролифератиных заболеваниях. Повышение интенсивности апоптоза наблюдается при вирусных заболеваниях, септических состояниях, при употреблении наркотических средств.

22. Показатели гуморального иммунитета в норме У\величение IgA происходит при хронических болезнях печени, аутоиммунных заболеваниях, миеломе, гломерулонефрите, алкогольной интоксикации. Снижению концентрации иммуноглобулина А способствуют физиологические изменения у ребенка до 6 месяцев, циррозное поражение печени, лучевая болезнь, терапия иммунодепрессантами, отравление организма химическими веществами. Уровень IgE растет при заражении паразитами, аллергических болезнях, крапивнице, бронхиальной астме. Снижение происходит при атаксии и телеангиэктазии (стойкое расширение мелких сосудов). Рост содержания IgG отмечается при аутоиммунных заболеваниях, миеломе, ВИЧ-инфекции, мононуклеозе инфекционной этиологии, инфекционных патологиях. Снижение иммуноглобулина G происходит в результате физиологических изменений у ребенка в возрасте до 6 месяцев, лучевой болезни, отравления химическими веществами, терапии иммунодепрессантами. IgM увеличивается при острых инфекциях, патологиях печени, аутоиммунных заболеваниях, васкулите. Уменьшение содержания происходит по тем же причинам, что и IgG, а также после спленэктомии (удаление селезенки). Антинуклеарные антитела повышаются при аутоиммунных патологиях, нефрите, хроническом гепатите, васкулите. Показатель АСЛО растет при острой форме гломерулонефрите, ревматизме, рожистом воспалении, скарлатине и инфицировании стрептококками. Антиспермальные антитела повышены при риске бесплодия. Показатель MAR-теста увеличен при вероятном бесплодии мужчины. Показатели АТ-ТГ и АТ-ТПО увеличиваются при аутоиммунном тиреоидите, болезни Грейвса, синдроме Дауна и Тернера. Анализ на ЦИК (циркулирующие иммунные комплексы) назначают при: обследовании на наличие аутоиммунных патологий и дефицита комплемента, иммунопатогенетических поражениях почек, артритах различной этиологии, персистирующей инфекции. Циркулирующие иммунные комплексы повышены при остром инфицировании организма, персистирующей инфекции, аутоиммунных патологиях, аллергическом альвеолите, гломерулонефрите в острой форме, местной анафилаксии, сывороточной болезни, эндокардите, злокачественных опухолях, болезни Крона. Также циркулирующие иммунные комплексы исследуют в рамках общего иммунологического обследования.

23. Примеры иммунограмм Острая пневмония в начальной фазе процесса (на вторые сутки после начала заболевания). Клинически и рентгенологически у обоих больных было установлено наличие очагов воспаления в нижних долях правого легкого Мужчина 39 лет • – лейкоцитоз • – наличие нейтрофильного сдвига влево при высоком проценте нейтрофилов, • – отсутствие эозннофилов, • – снижение количества лимфоцитов Мужчина 62 года Существенных сдвигов в иммунограмме нет Анализ иммунограмм во всей совокупности ее показателей, выявил ряд признаков, характеризующих начавшийся воспалительный процесс, в обоих случаях (СОЭ, снижение количестваВ-лимфоцитов, увеличение содержания нулевых клеток)

24. У мужчины 26 лет в иммунограмме: 1) Снижение содержания Т-хелперов при увеличении количества Т-супрессоров на фоне невысокого содержания лейкоцитов за счет пониженного уровня лимфоцитов. Однако и у здоровых людей подобные сдвиги лимфоцитов и лейкоцитов встречаются довольно часто. 2) Резкое снижение индекса Тх/Тс заставило предположить наличие у пациента активного иммунологического процесса. Инвертированное соотношение Т-хелперов и Т-супрессоров не исключает процесса, связанного с ВИЧ или туберкулезной инфекцией. 3). Клинические симптомы: резкая потеря в весе за последние месяцы, потливость по ночам, субфибрильная постоянная температуру, лимфоаденопатии верхней половины тела . 4). Серодиагностика показала инфицированность данного пациента ВИЧ У мужчины 23 года в иммунограмме: • По значениям параметров иммунограмма близка предыдущей. • Предположение о наличии у данного пациента ВИЧ не подтвердилось • Обнаружены положительные туберкулиновые пробы. Диагноз: туберкулез