Las Lipasas : Aplicaciones en Biotecnología

1. Las Lipasas : Aplicaciones en Biotecnología

2. Acilglicerolhidrolasas o triacilglicerolhidrolasas Definición : Una “lipasa verdadera” (EC 3.1.1.3) se define como una carboxilesterasa capaz de catalizar la hidrólisis y la síntesis de acilgliceroles de cadena larga, teniendo como sustrato standard a la trioleina.

3. Origen de las lipasas: • Las lipasas son enzimas ubicuas que pueden ser encontradas en: • Microorganismos • Plantas • Animales • Comercialmente en su mayoría son de origen microbiano • Hongos • Bacterias • Levaduras • Generalidades • Peso molecular 20-60 kD • Contienen 2-15% de carbohidratos • pH óptimo = 8-9 lipasas animales; 5.5-8.5 microbianas • Topt = 30-60 oC

4. Lipasas disponibles comercialmente

5. Pureza de lipasas disponibles comercialmente

6. Controversias en las propiedades de lipasas disponibles comercialmente

7. Clasificación reciente basada en los motivos conservados de su secuencia y en sus propiedades biológicas

8. C His Ser Asp/Glu N D A B C F 2 4 5 6 8 7 3 Propiedades estructurales : Plegamiento común de las lipasas • Patrón de plegamiento / compuesto por un “core” de  hebras rodeado por helices  tipico de numerosas hidrolasas • El sitio activo esta compuesto de una triada catalítica formada por Ser-His-Asp/Glu • A diferencia de muchas enzimas el sitio catalítico no esta expuesto en la superficie, se encuentra cubierto por residuos hidrofóbicos En rojo se presentan los motivos comunes a todas las lipasas En blanco se presentan los motivos presentes en la mayoría de las lipasas Las hélices A y F están en el lado cóncavo de las hebras  La hélice D esta a menudo compuesta de una sola vuelta

9. Mecanismo de activación interfacial en las lipasas

10. Mecanismo de activación interfacial en las lipasas C) estructura cerrada D)estructura abierta • El sitio catalítico de muchas lipasas se encuentra cubierto por una “tapa” formada por un “loop” • Este arreglo estructural hidrfóbico al interaccionar con superficies hidrofóbicas genera una estructura catalíticamente activa de tapa abierta • Se localiza desde el N terminal o desde el C terminal • Cutinasa (lipasa) no posee esta tapa

11. La presencia de la tapa cubriendo el sitio activo de las lipasas y el fenómeno de activación interfacial no adecuado para distinguir lipasas de esterasas. • Varias enzimas tienen la tapa hidrofóbica pero no presentan activación interfacial • p.e. Pseudomonas glumae, Pseudomonas aeruginosa, C.antarctica B, y lipasa pancreática, lipasa

12. Acceso al sitio catalítico de las lipasas C) estructura cerrada D)estructura abierta • Vista de arriba de la lipas de Mucor miehei • En rojo zonas polares y en azul zonas hidrofóbicas • En amarillo sitio activo

13. sn3 sn1 OR RO sn2 OR Sitio activo y especificidad en lipasas Se han identificado cuatro sitios de reconocimiento del sustrato en el sitio activo : Un agujero oxianión y tres sitios de unión específica de los residuos acilo en los triglicéridos, sitios sn-1, sn-2, y sn-3 del glicerol La diferencia de tamaño y del balance hidrofóbico/hidrofílico en estos sitios determina la especificidad de cada lipasa Especificidad por el tamaño de la cadena acilada Regioespecificidad sn-1, sn-2, y sn-3

14. Mecanismo catalítico

15. O O O O O + R3 R1 OH OH R1 R3 R1 OR2 OR2 OR2 Reacciones catalizadas por las lipasas Hidrólisis O O + + R2OH H2O R1 OR2 R1 OH Esterificación Esterificación O O O + + + + HOH HOH R2O R2OH R R1 OH OH R1 OR2 Transesterificación + Acidólisis O + + + + Alcoholisis R3OH R2OH R1 OR3

16. O O O O + R3 R1 OR4 OR4 R1 R3 OR2 OR2 (cont.) Interesterificación + Aminólisis O O O + + R3NH2 R2OH + R1 R OR2 R1 NHR3 Tioesterificación O O O + + + + HOH HOH R2SH R1 R OH OH R1 SR2 Amidación O O O + + R3NH2 HOH + R1 R OH R1 NHR3

17. Control del equilibrio termodinámico del proceso Control del grado de acilación de polioles Monoésteres, Diésteres, Triésteres…….. -Emulsificantes para especialidades farmacéuticas -Vehículos para medicamentos -Bloques de construcción en síntesis orgánica

18. Control de la posición del equilibrio termodinámico Actividad termodinámica: a = X  = coeficiente de actividad X = fracción mol El coeficiente de actividad termodinámica función del número del número y tipo de interacciones soluto-solvente

19. Control de la posición del equilibrio termodinámico en reacciones laterales • Bloqueo de la síntesis de di- y triésteres por aumento de sus coeficientes de actividad • Favorecer la síntesis de monoésteres por disminución de sus coeficientes de actividad

20. Coeficiente de actividad alto = baja interacción soluto-solvente, baja concentración al equilibrio • Coeficiente de actividad bajo = alta interacción soluto-solvente, alta concentración al equilibrio

21. trioleina dioleina monooleina Síntesis enzimática de monooleína : Glicerol + Ácido oléico en n-hexano • Buena solubilidad del ácido graso >0.5 M • Compatibilidad de las enzimas con solventes hidrofóbicos • Baja solubilidad del glicerol • Rendimiento alto: 80% • Baja selectividad por monoésteres • Trioleina 70% • Dioleina 27% • -Monooleina 3%

22. Síntesis selectiva de monoésteres de polioles

23. Modelo de predicción de la síntesis selectiva de monoésteres de polioles • Cálculo teórico de los coeficientes de actividad por UNIFAC • Calculo de las actividades termodinámicas de los productos al equilibrio • Buena correlación del modelo con resultados teóricos

24. Síntesis selectiva de monooleina por glicerólisis • Se pueden alcanzar concentraciones de producto entre 0.5-1 M • Proceso que se puede realizar en reactor contínuo

25. Síntesis selectiva de ésteres de xilitol

26. Síntesis selectiva de ésteres de xilitol

27. Coeficiente de actividad en función del parámetro de polaridad ET30 • Predicción de la abundancia de los prooductos en función de la polaridad del medio de reacción • Evaluado para un gran número de mezclas de solventes (acetona, acetonitrilo, DMSO, hexano, 2M2P, ……..)

28. Control de la quimioselectividad del proceso 2M2B Amida 95% Ester 52% n-hexane Amida 54% Ester 95% Baja actividad termodinámica deésteres en n-hexano Baja actividad termodinámica deamidas en 2M2B

29. Resolución de mezclas racémicas quimioselectivamente

30. Síntesis de inductores selectivos de apoptosis en células cancerosas 3-(4-Hydroxy-3-(S)-methoxy-phenyl)-N-[2-(4-hydroxy-phenyl)-2-methoxy-ethyl]- acrylamide Síntesis preferencial deamidas en 2M2B Reacción enantioselectiva

31. The Chiral Market • Market Share Forecast Growth of Biological Decline of Traditional

32. 25% : (2S,4S) 50% : (2R,4R) 25% : (2R,4S) • Enantioselectividad Poderosos Bloques de construcción en química orgánica • Enzimas mas utilizadas: • Lipasas • Esterasas • Amidasas

33. Resolución cinética con lipasas Evitar reversibilidad de la resolución

34. Generación de centros quirales por acilación • Bloques de construcción en síntesis orgánica • Construcción de librerias • Resolución de centros quirales (en polioles) • Modelos moleculares para RMN

35. “Easy-On, Easy-Off Technology” Sintesis-hidrólisis de amidas “Imposible” la hidrólisis de amidas con lipasas Proceso altamente enantioselectivo

36. Sistemas de reacción para las lipasas SOLVENT SYSTEMS AND PROCESSES 1. Aqueous Reaction Media : Hidrolysis 2. Water: Water-Miscible Systems : Hydrolysis or Synthesis 3. Water: Water-Immiscible Systems : Hydrolysis or Synthesis 4. Nonaqueous Reaction Media : Synthesis 5. Anhydrous Reaction Media : Synthesis 6. Supercritical Fluids : Synthesis 7. Reverse Micellar Systems : Synthesis Sistemas con bajo 8. Solvent-Free Systems : Synthesis contenido de agua 9. Gas-Phase Catalysis : Synthesis 10. Ionic Liquids : Synthesis

37. PREPARATION OF MODIFIED LIPASES • Immobilization • Adsorption onto solid supports such as silica gel • Covalent attachment to solid supports • Entrapment in organic polymers or microemulsions. • B. Chemical Modification • Cross-Linking : • Use of glutaraldehyde to prepare insoluble cross-linked enzyme crystal (CLEC) • P. cepacia and C. antarctica lipases for CLEC-catalyzed resolution of phenyl acetate (ALTUS-Biotech)

38. 2. Modification with Polyethylene Glycol, Polymers and Surfactants • Enhanced stability of C. rugosa lipase in isooctane by treating the enzyme with p- nitrophenyl chloroformate and cyanuric acid chloride activated PEG. • Alternative to PEG is to use the nonionic amphiphilic polyoxyethylene lauryl ether (Brij 35) as a covalent modifier • Hydrophobic polymers such as polystyrene and polymethyl • methacrylate or amphiphilic polymers such as poly N-vinylpyrrolidone • Nonionic synthetic dialkyl amphiphiles or sorbitan monostearate (Span 60)

39. Aplicaciones industriales de las lipasas • Aplicaciones en oleoquímica : Hidrólisis de triglicéridos • Disponibilidad de materia prima, 60 millones de tons de aceites y grasas por año. • Cinco millones de toneladas para uso no alimentario • La principal aplicación es la obtención de jabones, proceso químico • El uso alternativo de las lipasas (hidrólisis de grasas y aceites) permite condiciones mas suaves, mejor calidad del producto y mejor rendimiento de glicerol como subproducto • Miyoshi Yushi, en Nagoya, Japón, la única empresa en el mundo que usa esta tecnología con Candida rugosa lipase. • Proceso en lote a 40 oC, durante 48 horas

40. Síntesis de metil- o etil- ésteres de ácidos grasos por alcoholisis : Biodiesel • An alternative source of energy for public transport is the so-called biodiesel, reduces sulfur oxide production. • METHYL ESTERS OF FATTY ACIDS • Produced chemically using oil from various plants (e.g. rapeseed). • Alcohoysis catalyzed by KOH • Can be catalysed in a single transesterification reaction using lipases in organic solvents. • At an industrial scale failed so far because of the high cost of the appropriate biocatalyst. • Two strategies were recently presented : • Immobilisation of P. fluorescens lipase increased its stability even upon repeated use • Cytoplasmic overexpression of Rhizopus oryzae lipase in Saccharomyces cerevisiae with subsequent freeze-thawing and air drying resulted in a whole-cell biocatalyst

41. sn3 sn3 sn3 sn3 sn1 sn1 sn1 sn1 OX OX OR OR XO RO RO XO sn2 sn2 sn2 sn2 OX OX OR OX Mejoramiento de la untabilidad de los aceites Se puede modular el punto de fusión de una grasa por hidrogenación de dobles enlaces Un metodo alternativo es la incorporación de ácidos grasos saturados al aceite por interestificación enzimática Lipase + +

42. sn3 sn1 OR XO sn2 OY • Síntesis de sustitutos de grasa de cacao • En 1995 100,000 toneladas de grasa de cacao fueron exportadas por Kenia y Malasia • Grasa con demanda en alimentos y farmacia (Pf = 37 oC) Para X = oléico, Y = esteárico y R = palmítico Grasa de cacao compuesta de SOS o SOP primordialmente • Interesterificación enzimática del aceite de palma (POP) o de girasol (OOO) con ácido esteárico o triesterarina (SSS). • Uso de lipasas 1,3 específicas en proceso limpio • Unichema (ICI) produce varios cientos de toneladas y Fuji Oil varios miles de toneladas utilizando lipasas de Rhizopus.

43. sn3 sn1 OR XO sn2 OY • Grasas de alta digestibilidad • Mejoramiento en la absorción de triglicéridos • Triglicéridos con palmítico en posición sn-2 mejor absorción Para X = palmítico Grasas de alta digestibilidad, p.e. leche materna • Unichema produce OPO en dietas para niños prematuros por interestirificación de tripalmitina y ácido oléico • Otro tipo de grasas de facil digestión son MLM (M=medium, L=long refiriendose al tamaño de cadena acilada) • “Caprenin” (C6,C22:0,C8) producido por Procter&Gamble mediante síntesis química

44. Síntesis de emulsificantes • Monoglicéridos emulsificantes mas utilizados en la industria de alimentos • 150,000 ton preparadas por glicerólisis química a partir de triglicéridos • Los métodos enzimáticos incluyen : • Esterificación y glicerólisis • Bajos rendimientos y proceso económicamente desfavorable • Necesidad de abaratar el costo del biocatalizador y aumentar su estabilidad operacional

45. Aplicaciones diversas (Hidrólisis) • Detergentes: Remoción de productos lipídicos • Productos comerciales : Lipolasa de Novo-Nordisk, Lipomax de Gist-Brocades y Lumafast de Genencor. • Industria papelera : Eliminación de triglicéridos de pulpa de celulosa o eliminación de tintas a base de lípidos en papel reciclado por Nihon Seishi Co., • Industria de lacteos : mejorar la calidad de cuajadas, generación de aromas y sabores en quesos o preparación de aditivos a partir de productos lacteos

46. Viejas enzimas Nuevas reacciones Nü Nü Nü =Nucléophile Promiscuidad Catalítica: Single-enzyme multi-step conversions

47. “Catalytic promiscuity in enzymes is the ability of enzyme active sites to catalyze more than one chemical transformation” • Posibilidad de las enzimas para reaccionar sobre: • Diferentes grupos funcionales • Diferentes tipos de enlace • Diferente mecanismo de reacción • Angew. Chem. Int Ed.2004, 43, 6032-6040

48. Nucleófilo Ataque nucleofílico enlaceC-C Reacciones de adición tipo Michael catalizadas por lipasas • Formación de enlaces C-C Nucleófilos Electrófios

49. 50°C Solvant organique a) Torre, O.; Alfonso, I.; Gotor, V.; Chem. Commun.2004, 1724; 14; b) Cai, Y.; Wu, Q.; Xiao, Y. M.; Lv, D. S.;Lin, X. F. J. of Biotech., 2006.

50. Mecanismo Clásico