第五章诊断酶学

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主要内容 一、酶的一般特征五、酶的免疫化学测定二、血清酶六、同工酶和亚型的测定三、酶促反应动力学七、工具酶及其临床应用八、临床常用血清酶及其同工酶四、酶活性浓度测定技术

第一节酶的一般特征 一、基本概念二、酶的结构与催化作用三、酶的命名分类及编号返回章

一、基本概念 1. 酶、核酶。 2. 酶的催化特性：极高的催化效率、高度的特异性、催化作用的可调节性。 3. 酶促反应：酶所催化的反应。酶活性：酶催化反应的能力。底物(S)：酶所作用的物质。产物(P)：酶促反应的生成物。酶的激活剂:加速酶促反应的物质。酶的抑制剂: 减慢或终止酶促反应的物质。返回节

二、酶的结构与催化作用 单纯酶和结合酶单纯酶：只含多肽链，是单纯蛋白质。结合酶：由酶蛋白和辅因子组成。两者结合后形成的复合物称为全酶。与酶蛋白结合疏松的称为辅酶。与酶蛋白结合牢固的称为辅基。酶的活性中心　　酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的一个特定区域。酶的催化作用机制　　诱导契合学说。返回节

三、酶的命名、分类及编号 返回节

第二节血清酶 一、血清酶的来源二、血清酶的去路三、血清酶的生理变异四、血清酶变化的病理机制返回章

一、血清酶的来源 血浆特异酶　为血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥特定的催化作用。多数由肝脏合成并以酶原形式分泌入，在一定条件下被激活起作用。与凝血有关的酶或酶原、ChE、Cp及LPL等。非血浆特异酶外分泌酶：由外分泌腺合成并分泌进入血浆的酶,包括P-AMY、P-LPS、前列腺ACP等。细胞内酶：存在于细胞内进行物质代谢的酶，随着细胞的不断更新或破坏可少量释入血液。当其大量出现于血清中时，提示酶的来源组织细胞受损，最常用于临床诊断。返回节

二、血清酶的去路 血清酶的半寿期 (T1/2) 定义：酶失活至原来一半时所需时间。半寿期代表酶从血中清除的快慢。半寿期长的酶，在血清中持续时间长。血清酶的失活和排泄酶的清除主要是在血管内失活或分解。血清酶经蛋白酶水解产物（多肽或氨基酸）可经小肠粘膜排至肠腔，再彻底分解成氨基酸后被重吸收，其中大部分可被组织利用，不能利用的氨基酸则随尿排出体外。返回节

三、血清酶的生理变异 1.性别少数酶如CK、ALP及GGT等有性别差异，与血清酶的来源组织有关。 2.年龄血清酶的活性随年龄而变化，ALP和GGT到老年时可有轻度升高。年龄差异也见于同工酶。 3.进食过量饮酒可使血清GGT明显升高。 4.运动多种血清酶活性升高，如CK、LD、AST、ALD和ALT 等，其升高的幅度与运动量、持续时间、运动频率及骨骼肌所含的酶量有关。 5.妊娠胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热ALP、 LD、LAP和ALT（少数）等，引起血清中这些酶活性升高。 6.其他一些酶活性与体重、身高的增长、体位改变、昼夜变化及家庭因素有关。返回节

四、血清酶变化的病理机制 酶合成异常 • 合成减少 • 合成增多酶释放增加:大多数血清酶增高的主要原因 • 细胞内外酶浓度差异 • 酶蛋白分子量的大小 • 酶的组织分布 • 酶在细胞内定位和存在形式酶的清除异常　不同疾病和不同的酶从血中清除时间和机制不同。如AMY和ALP经肾脏或胆道排出异常而致血清酶升高。返回节

　第三节酶促反应动力学 一、米－曼氏方程二、Km与Vmax 三、酶促反应进程曲线四、影响酶促反应的因素返回章

一、米－曼氏方程 • Michaelis 和Menten提出的酶作用的中间产物学说: K1 K3 E+S ES E+P K2 • 1913年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系的方程式，即米-曼氏方程(Michaelis-Menten equation): 返回节

二、Km与Vmax Km值：等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半时的底物浓度，即V＝½Vmax时，则Km＝[S]。Km 在临床上的应用：　反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比。用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最　　大反应速度的百分率。　根据Km值选择酶的最适底物。确定工具酶用量。确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依据。 Vmax：酶完全被底物饱和时的反应速度，代表了在一定酶量下的最大反应速率。返回节

酶促反应时间进程曲线(S为底物，P为产物)

三、酶促反应进程曲线 底物耗尽期线性反应期 ——必须根据线性反应期的反应速率才能准确计算出酶活性浓度。延滞期如将酶反应过程中测得的产物[P]或底物[S]变化量对时间作图，可得酶促反应时间进程曲线。图中产物[P]或底物[S]变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。返回节

四、影响酶促反应的因素 底物浓度对酶促反应的影响（1）当[S]<<Km时，反应速率与底物浓度[S]成正比，呈一级反应， V＝Vmax[S]/Km＝K[S] 用工具酶来测定各种代谢物浓度的方法学基础。（2）当 [S]>>Km时，反应速率与底物浓度[S]无关， V＝Vmax＝K [E] 称为零级反应，反应速率与酶浓度[E]成正比。酶学测定时一般底物浓度可选择为Km的10～20倍。返回节

常见酶温度转化系数

　第四节酶活性浓度测定技术 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度（v）达到最大速度Vmax，即在过量底物存在下的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度[E]之间存在线性关系。一、酶活性浓度测定方法二、酶偶联法三、血清酶活性浓度测定条件的选择四、酶活性浓度的单位五、系数K值的计算与应用六、临床酶学测定的标准化返回章

一、酶活性浓度测定方法 1.按反应时间分类: 定时法连续监测法 2.按检测方法分类：量气法、分光光度法、荧光法其它方法（放射性核素法、离子选择电极法，旋光法、极谱法、HPLC或生物发光法等）。返回节

按检测方法分类——底物或产物浓度的检测 返回节

定时法（固定时间法） 测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变化的总量，计算酶促反应平均速度。 • 优点：比较简单，最后测定时因酶促反应已被终止，故所用仪器无需恒温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。 • 缺点：无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线性期。利用该法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要非常精确，否则会引起较大误差。返回节

连续监测法 又称速率法或动力学法，指在酶促反应过程中用仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间的变化量，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。 • 优点：无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂，就反应物变化的多点测定结果连接成线，观察到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶活性，结果准确可靠。要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能，自动生化分析仪都能达到这些要求。返回节

连续监测法的种类 直接法是指待测酶酶促反应的底物或产物有特征性的理化性质，然后通过特殊的仪器直接检测。 • 基于NADH或NADPH的反应原理：LD、α-HBD等 • 基于人工合成色素原底物：ALP 、GGT、AMS等 • 基于氧的消耗：各种氧化酶间接法是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质，需通过另一个化学反应或生化反应，将底物或产物转化为有明显特征理化性质的另一个化合物。用直接法来测定的酶类非常有限，很多情况下不得不使用间接法。 • 化学法：如ChE的丁酰硫代胆碱测定法。 • 酶偶联法返回节

二、酶偶联法 酶偶联反应最简单的模式为： Ex 为待测酶，A为底物，B为中间产物。A、B二物质的变化无法直接监测，此时可外加第二个酶Ei(为指示酶)，其底物为B，反应产物为P可直接测定。返回节

辅助反应 如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶，将二者连在一起，此反应称为辅助反应。模式为：其中，B、C均为中间产物，Ea、Ei都为工具酶。最后一个酶称指示酶Ei，其他外加的酶都为辅助酶（Ea）。返回节

酶偶联反应原理 (1)当用酶偶联法测定时，在偶联反应中存在几个时期：预孵育期、延滞期、恒态期、非恒态期。 (2)延滞期是酶偶联反应与一般酶反应的一个重要区别。从酶反应开始至稳态期间，指示酶反应较慢且不稳定，称为延滞期。在这期间指示酶反应速度不能代表测定酶量多少。 (3)设计和选择酶偶联测定方法时，延滞期越短越好，测定时间要避开此期。返回节

酶偶联法测定ALT的吸光度变化图 返回节

对酶偶联反应的要求 指示酶反应必须是一级反应酶反应速度与指示酶底物浓度相关。工具酶催化的最大反应速度必须远远大于测定酶，其所催化的反应必须在中间产物浓度很低的条件下进行，并且将此很快转变为最终产物，反应体系中不应有中间产物堆积，否则导致误差。工具酶作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶。返回节

指示酶、辅助酶的浓度计算方法一 　根据Vx/(Km)x：Vi/(Km)i的比值来选择指示酶的用量Vi，式中Vx为测定酶的测定上限。比值为1:10、 1:100、 1:1000时，误差28％、 4％、 0.7％。实例：　在肌酸激酶测定法中，CK的Km为2.4mmol/L，指示酶G-6-PD的Km为0.27mmol/L，如将CK测定上限定为450U/L（实际测定时标本稀释60倍，实际为7.5U/L），如希望上述比例为1:100。代入上式： Vx/(Km)x：Vi/(Km)I=1:100 Vi＝3.1×10－3×min－1×0.27mmol×100 ＝8.37×10－2×mmol×min－1 ×L －1 ＝83.7U/L 如反应体系为1ml，只需0.0837U的G-6-PD 即可。返回节

指示酶、辅助酶的浓度计算方法二 根据米氏方程式来计算，在酶偶联反应中，指示酶催化速度(Vi) 的米氏方程式为：　以天冬氨酸氨基转移酶（AST）为例希望中间产物P浓度很低，定为0.001mmol/L，指示酶苹果酸脱氢酶Km为0.0165mmol/L，如设定AST上限为300U/L（标本为1:12稀释，实测上限为25U/L）。代入上式： Vi＝0.0014mmol min－1＝1.4U 得1.4U，如反应体系为3ml，则试剂中苹果酸脱氢酶用量为466U/L,目前试剂中用量为600U/L。从以上计算来看，试剂中用量是足够的。返回节

三、血清酶活性浓度测定条件的选择 方法条件的选择尽可能采用连续监测法；减少步骤, 化学试剂有一定纯度,双蒸水,使用双试剂。测定参数的设置方法类型、波长、样品量与试剂量、稀释水量、试剂吸光度上下限、空白速率、反应孵育时间、延迟,监测时间、底物耗尽限额、线性范围及计算因子F值。标本的采集、运输与保存影响因素：溶血、抗凝剂、温度等。干扰因素的控制反应干扰。污染。底物自行发生反应。返回节

不同贮存温度时体液酶的稳定性 *酶不耐融化；§与同工酶类型有关；※标本未酸化；#标本加枸橼酸或醋酸至pH 5

四、酶活性浓度的单位 酶活性单位 • 惯用单位惯用单位是酶活性测定方法的建立者所规定的单位。由于单位定义不同，参考范围差别很大，难以进行比较。 • 国际单位（IU）在特定的条件下，每分钟转化1mol底物的酶量为一个国际单位。以IU表示，1IU=1mol.min-1。 • Katal单位在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶量为1kat， 1kat=1mol.s-1。常用单位为katal或 nkatal。 Kat与IU的换算关系为： 1IU=1mol·min-1=16.67nmol·s-1= 16.67nkatal 返回节

酶活性浓度单位 临床上酶活性浓度采用每单位体积（升）所含的酶活性单位数表示。酶活性浓度单位的计算连续监测法根据摩尔消光系数进行酶活性浓度的计算。公式如下：返回节

参考范围与正常上限升高倍数（ULN） 由于临床实验室进行酶学测定时所选仪器、试剂和方法不同，加之生物学变异等对酶活性影响，常常导致实验室之间所得参考范围差别甚远，应根据各自情况对各种酶建立自己的参考值。所谓正常上限升高倍数（ULN）是指用测得的酶活性结果除以参考范围上限。便于比较来自不同方法的结果；如将ULN进一步适当分级，更制定出轻度、中度及极度增加的范围，一目了然。有些酶测定要考虑到不同性别、年龄时间时，用ULN换算更能正确表达，就不致发生误判。返回节

临床常用血清酶的测定方法与参考范围（37℃）临床常用血清酶的测定方法与参考范围（37℃） *国际临床化学联合会（IFCC）参考方法；#实际为拟胆碱酯酶（PChE）返回节

五、系数K值的计算与应用 用自动生化分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论上来讲V、v和L均为固定值，为常数，则将公式简化为如LD活性浓度，已知NADH的为6.22103·cm-1.mol-1，血清量为50l，底物液为1ml，比色杯光径为1cm，则 F=1.05106/6.22 1030.051=3376 返回节

连续监测法中常数K值的设置 测定酶的判断值或参考范围上限，保证测定的可靠，所以转氨酶的常数K一般在3000左右，不少人宁愿在1500 左右。应考虑到测定时间，测定时间短到0.5分，此时0.001嗓音对每分钟△A误差将是0.002，反之，测定时间延长到2分钟，误差也小一半。即测定时间长，则K值可以设置大一些，如测定时间只有0.5分钟，K值一般不超过4000。改变K值最方便的途径就是改变标本稀释度，稀释倍数愈大，K值愈大。返回节

连续监测法中常数K值的检验 • 摩尔吸光系数（ε）对一定物质而言常是一个定值，但在一些外界条件影响下也会有所变化。对硝基酚：当pH＞10时，405nm处其ε为18500。 NAD(P)H：当波长大于334nm时，随温度升高，同一波长的ε值会轻度下降。 • ε值在近似单色光的光源条件下才能成立。 • 实际K值的测定。一些性质稳定的物质如对硝基酚.用高纯试剂配成标准品或直接购买，计算出实际K值。 NAD(P)H反应有关酶测定的K值。葡萄糖终点法测定，产生与葡萄糖相等摩尔数的NAD(P)H。返回节

六、临床酶学测定的标准化 • 使用推荐方法和参考方法 • 使用公认的酶校准物或酶参考物标准化途径酶活性浓度测定的参考系统 • 建立原级参考方法 • 制备原级参考物 • 建立参考实验室网络返回节

第五节酶的免疫化学测定 酶的免疫化学测定方法　放射免疫测定（RIA）、免疫抑制法、化学发光免疫测定（CLIA）、酶免疫测定（EIA）、荧光酶免疫测定（FEIA）。免疫化学法的结果报告方式（1）用酶活性浓度单位，结果以U/L表示。（2）用质量浓度单位，结果直接用ng/ml或g/L表示。血清酶活性与酶质量的变化的关系注意两者之间的差异，如CK-MB活性与质量不平行。返回章

酶的免疫化学测定的优缺点 优点： • 灵敏度高，能测定样品中少量或痕量酶。 • 特异性高，不受体液中其他物质的影响。 • 能测定一些不表现酶活性的酶蛋白； • 特别适用于测定同工酶。局限性： • 制备足够量的提纯酶和抗血清非常困难且工作量大。 • 测定步骤多，操作繁琐。 • 测定成本高。返回节

第六节同工酶及亚型的测定 一、同工酶的概念及分类二、同工酶的分析方法返回章

一、同工酶的概念及分类 概念：同工酶是催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质不同的一组酶。亚型指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异形成的多种形式的一类酶。往往在基因编码产物从细胞内释入血浆时因肽酶作用降解而形成。分类：简单分类——原级同工酶和次级同工酶。基因分类——单基因决定的同工酶、复等位基因同工酶、多基因决定的同工酶和修饰的同工酶等四类。返回节

二、同工酶的分析方法 返回节

电泳法 电泳材料：醋酸纤维素薄膜、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、等电聚焦及毛细管电泳等。区带显色：各同工酶区带进行酶促反应显色后，扫描定量，而颜色的深浅与同工酶活性成正比。巨分子酶产生的原因：酶与免疫球蛋白形成复合物，如CK-BB-IgG 。酶与其他蛋白质形成复合物，如LD-β-脂蛋白。酶亚基或分子之间形成聚合物，如CK-Mt聚合物、LD亚基自身聚合等。返回节

层析法 层析法：利用同工酶分子量大小、所带电荷多少的不同，以及受某些离子交换剂吸附的强弱程度不同来进行分离鉴定的方法。柱层析，如离子交换层析和亲和层析等。因操作方法费时繁琐，一般不用于临床同工酶常规检测，而主要用于同工酶的分离、制备、纯化。返回节

免疫分析法 免疫抑制法根据同工酶的某一种亚基与相应的抗体结合后，酶活性受到抑制，可算出该型同工酶的活性。如CK-MB活性测定。免疫沉淀法该法利用同工酶抗体形成抗原抗体复合物沉淀的原理，减去法可算出同工酶的活性。其他免疫学方法测定酶蛋白利用酶是蛋白类抗原但含量极微的特点，可应用免疫电泳、RIA、EIA和 CLIA等方法。这类方法的最大特点就是与酶活性无关，测定酶的质量。返回节

动力学分析法 底物特异性分析法利用不同的同工酶对底物的亲和力的差异即可进行分析。抑制剂分析法利用同工酶之间结构的不同而对同一种抑制剂有不同的亲和性和反应性来进行分析。 pH分析法利用不同的同工酶可有不同的最适pH进行分析。热失活分析法利用不同同工酶的耐热性不同来进行分析与鉴定。返回节

第五章 诊断酶学