微生物检测实验室的设施与设备验证

微生物检测实验室的设施与设备验证

实验室设施与验证 药品，鉴于它治病救人的特殊作用，在生产环境中除了对非生命污染物———微粒要加以限制外，还必须对有生命的污染物———微生物做出必要的规定。因为它们对药品的污染比微粒更甚，不加以控制则对人体危害更为严重。

微生物多指细菌和真菌，可以在一切地方产生，有很强的繁殖力。空气中的微生物多数附着在灰尘上，也有的以芽孢状态悬浮在空气中。微生物污染是指因微生物产生、附着而给特定的环境带来的不良影响。由于微生物不断生长和繁殖，因此它是“活的粒子”微生物多指细菌和真菌，可以在一切地方产生，有很强的繁殖力。空气中的微生物多数附着在灰尘上，也有的以芽孢状态悬浮在空气中。微生物污染是指因微生物产生、附着而给特定的环境带来的不良影响。由于微生物不断生长和繁殖，因此它是“活的粒子”

不同环境中微生物量也不相同（见表1-1）。在温度、湿度条件宜的情况下，它们一昼夜可增殖1021-24倍，因而对微生物的控制尤为重要。不同环境中微生物量也不相同（见表1-1）。在温度、湿度条件宜的情况下，它们一昼夜可增殖1021-24倍，因而对微生物的控制尤为重要。

洁净室（无菌室） 正是因为这些原因，药品生产企业洁净室必须同时对生产环境中的微粒和微生物加以控制。国家药品监督管理局颁布的《规范》附录中提出的药品生产洁净室（区）的空气洁净度级别（见表1-3）就体现了这方面的要求，同时也反映出药品生产企业洁净室不同于其他工业洁净厂房的特点。

洁净室设计确认的要点 面积：5m2～10m2 高度：不超过2.4m 缓冲间：1～2个室内温度：18℃～26℃ 室内湿度：45%～65%

洁净室地面 • 实验室地面要求能承受得住预定在房间内的生产活动，底层地面承重一般为：≥7.8MPa底层地面构造重点要解决一个基层防潮的性能问题。 • 环氧树脂地坪

洁净室墙壁 • 实验室墙壁应选用气密性良好且在温度和湿度等变化作用下变形小的材料，不得含木质和纤维材料。墙壁和顶棚表面应光洁、平整、不起灰、不落尘、耐腐蚀、耐冲击、易清洗，应减少凹凸面。“墙与地面的交界处宜成弧形，或采用其他措施以减少灰尘积聚和便于清洗”。

洁净室的门窗 • 洁净室内的窗尽量采用大玻璃，这样可减少积灰点，又有利于清洁工作。洁净室窗若为单层的，则窗台要做成斜面。双层窗更适用于洁净度高的房间，因两层玻璃各与墙面平，无积灰点。洁净室的门窗材料应选择耐候性好、自然变形小、制造误差小、容易控制缝隙、气密性好的材料。

洁净室的吊顶 • 洁净室的吊顶，各种管道、灯具、通风口及其他公用设施，在设计和安装时应考虑使用中避免出现不易清洁的部位。

洁净室的气流组织 目前洁净室采用的主要气流组织有：乱流、层流（包括单向流、平行流）和矢流三种方式。

乱流乱流方式主要是利用稀释作用，使室内尘源产生的灰尘均匀扩散而被“冲淡”。它的原则是满足工艺和人的卫生要求，避免涡流把工作区外的灰尘卷入工作区，以减少药物的污染机会。一般采用上送下回的形式，使气流自上而下，与尘粒重力沉降方向一致。

乱流方式由于受到送风口形式和布置的限制，不可能使室内获得很大的换气次数（相对于平行流来说），且不可避免地室内存在涡流，因而室内洁净度不可能很高，可达到1000级至300000级。在一定的换气次数下，室内洁净度取决于人员的多少及其动作状态。乱流方式的洁净室构造简单，施工方便，投资和运行费用较小，因而药品生产上大多数洁净室都采用此方式。乱流方式由于受到送风口形式和布置的限制，不可能使室内获得很大的换气次数（相对于平行流来说），且不可避免地室内存在涡流，因而室内洁净度不可能很高，可达到1000级至300000级。在一定的换气次数下，室内洁净度取决于人员的多少及其动作状态。乱流方式的洁净室构造简单，施工方便，投资和运行费用较小，因而药品生产上大多数洁净室都采用此方式。

层流层流方式是指流线平行、流向单一、具有一定的和均匀的断面速度的气流组织方式，送入房间的气流充满整个洁净室断面，它像“活塞作用”那样把室内随时产生的灰尘压至下风侧，再把灰尘排至室外。由于这种方式是以要求室内断面上有一定风速为前提的，所以洁净室在净化空调系统开动后能立即（1min 以内）达到稳定状态。当室内污染发生时即能迅速排走，不致扩散而影响洁净度。

层流方式分为垂直层流和水平层流两种。 垂直层流：在天棚上满布高效过滤器，回风可通过格栅地板，空气经过操作人员和工作台时可将污染物带走。由于气流为单一方向，故操作时产生的污染物不会落到工作面上去，可在操作区保持无菌无尘，达到100级洁净度。若以侧墙下部回风口代替格栅地板，气流方式改为“全顶送风侧下回风”，只要回风口位置足够低的话，则在地面以上0.8-1.0m高度处的气流仍可保持层流特性，为准垂直层流方式。

水平层流 在一面墙上满布高效过滤器作为送风墙，对面墙上满布回风格栅作为回风墙。洁净空气沿水平方向均匀地从送风墙流向回风墙。操作面离高效过滤器越近，能接受到最干净的空气，可以达到100级洁净度，依次下去便可能是1000级、10000级。不同地点可能得到不同级别的洁净度。

矢流矢流方式是一种新型的气流组织方式，也叫辐流、斜流，是采用弧形送风口送风，于侧上角送风，对侧下角回风。它的净化功能不同于乱流方式的掺混稀释作用，也不同于层流方式的时均流线平行的活塞作用，而是靠流线不交叉的气流的推动作用，将室内污染物排出室外。矢流方式可以达到100级洁净度，但其弧形送风口面积只为层流方式满布高效过滤器的送风面积的1/3，设备的投资和能耗也大大减少。

当产品要求洁净度为100级时，选用层流流型（或矢流流型）；当产品要求洁净度为1000-300000级时，选用乱流流型。垂直层流的送、回风方式是顶送下回，水平层流的送、回风方式是侧送侧回；乱流洁净室的送、回风方式为顶送（双）单下侧回、上侧送下侧回、上送上回。当产品要求洁净度为100级时，选用层流流型（或矢流流型）；当产品要求洁净度为1000-300000级时，选用乱流流型。垂直层流的送、回风方式是顶送下回，水平层流的送、回风方式是侧送侧回；乱流洁净室的送、回风方式为顶送（双）单下侧回、上侧送下侧回、上送上回。

压力控制 洁净室染菌，往往是室外污染空气通过吊顶处风口及灯框处的缝隙流人室内而引起的。为了维持洁净室的洁净度免受邻室的污染或者污染邻室，在洁净室内应维持一个高于邻室或低于邻室的空气压力，同时为了防止外界污染物随空气从围护结构的门窗或其他缝隙（如灯框）渗入洁净室内，以及防止当门开启后空气从低洁净区流向高洁净区，必须使洁净室对相邻房间或走廊维持一个正的静压差（正压），有时则需要维持负的静压差（负压）。这是空气净化中的又一项重要措施。

如某100级洁净室相对10000级的邻室来说，其正压值应大于5Pa但相对于室外来说，其正压值应大于10Pa。如某100级洁净室相对10000级的邻室来说，其正压值应大于5Pa但相对于室外来说，其正压值应大于10Pa。制造或分装青霉素等药物的洁净室有特殊要求，既要阻止外部污染的流入，又要防止内部空气的流出，因此室内要保持正压，与相邻房间或区域之间则要保持相对负压。

洁净室内设计的称量室，其空气洁净度级别应与生产要求一致，并有捕尘和防止交叉污染的设施。尽可能采用独立小空间，这样有利于提高排风和除尘效率，也有利于不同品种原料的称量。称量室在空调设计中特别要注意保持负压状态，在设计中特别要注意减少积尘点。洁净室内设计的称量室，其空气洁净度级别应与生产要求一致，并有捕尘和防止交叉污染的设施。尽可能采用独立小空间，这样有利于提高排风和除尘效率，也有利于不同品种原料的称量。称量室在空调设计中特别要注意保持负压状态，在设计中特别要注意减少积尘点。

洁净室的使用管理 建立使用登记制度药厂各个微生物检测检验室都要建立使用登记制度。在登记册中可设置以下项目内容：如使用日期、时间、使用人、设备运行状况、温度、湿度、洁净度状态（沉降菌数、浮游菌数、尘埃粒子数）、报修原因、报修结果、清洁工作（台面、地面、墙面、天花板、传递窗、门把手）、消毒液名称等。

建立使用标准操作规范（SOP） 1.规定净化系统使运转时间要求每次实验前应开启净化系统使运转至少1h以上，同时开启净化台和紫外灯。

2.物品进入洁净室（无菌室）基本要求：凡进入洁净室（无菌室）的物品必须先在第一缓冲间内对外部表面用消毒剂消毒灭菌，再经物流缓冲间、传递窗1h以上，及无菌空气吹干后送入无菌室。注意带纤维、易发尘物品不得带进净化实验室。无菌室内固定物品不得任意搬出。 2.物品进入洁净室（无菌室）基本要求：凡进入洁净室（无菌室）的物品必须先在第一缓冲间内对外部表面用消毒剂消毒灭菌，再经物流缓冲间、传递窗1h以上，及无菌空气吹干后送入无菌室。注意带纤维、易发尘物品不得带进净化实验室。无菌室内固定物品不得任意搬出。

3.人员进入洁净室（无菌室）要求：实验人员进入洁净室（无菌室）不得化妆、带手表、戒指等首饰；不得吃东西、嚼口香糖。应清洁手后进入第一缓冲间更衣，同时换上消毒隔离拖鞋，脱去外衣，用消毒液消毒双手后戴上无菌手套，换上无菌连衣帽（不得让头发、衣等暴露在外面），戴上无菌口罩。然后，换或是再戴上第二副无菌手套，在进入第二缓冲间时换第二双消毒隔离拖鞋。再经风淋室30s风淋后进入无菌室。 3.人员进入洁净室（无菌室）要求：实验人员进入洁净室（无菌室）不得化妆、带手表、戒指等首饰；不得吃东西、嚼口香糖。应清洁手后进入第一缓冲间更衣，同时换上消毒隔离拖鞋，脱去外衣，用消毒液消毒双手后戴上无菌手套，换上无菌连衣帽（不得让头发、衣等暴露在外面），戴上无菌口罩。然后，换或是再戴上第二副无菌手套，在进入第二缓冲间时换第二双消毒隔离拖鞋。再经风淋室30s风淋后进入无菌室。

4.温湿度观察要求：观察温度计、湿度计上显示的温湿度是否在规定的范围内，并作为实验原始数据记录在案。如发现问题应及时寻找原因，及时报修和及时报告实验室主管，并将报修原因和结果记录归档。 4.温湿度观察要求：观察温度计、湿度计上显示的温湿度是否在规定的范围内，并作为实验原始数据记录在案。如发现问题应及时寻找原因，及时报修和及时报告实验室主管，并将报修原因和结果记录归档。

5.沉降菌落计数与浮游菌测定要求：在每次实验同时，对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数，将结果记录在使用登记本上，并作为实验环境原始数据记录在实验报告上。每周1次，或在无菌检查等必要时，在每次实验同时对操作室和净化台进行浮游菌测定，将结果记录在使用登记本上，并作为实验环境原始数据记录在实验报告上。 5.沉降菌落计数与浮游菌测定要求：在每次实验同时，对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数，将结果记录在使用登记本上，并作为实验环境原始数据记录在实验报告上。每周1次，或在无菌检查等必要时，在每次实验同时对操作室和净化台进行浮游菌测定，将结果记录在使用登记本上，并作为实验环境原始数据记录在实验报告上。

6.消毒要求：无菌室每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭或2%甲酚液或其他适宜消毒液（常用消毒剂的品种有：5—20倍稀释的碘伏水溶液、0.1%新洁尔灭溶液、1：50的84消毒液、75%乙醇溶液、3%碘酒溶液、5%石炭酸（来苏儿）消毒溶液、2%戊二醛水溶液、尼泊金乙醇消毒液（处方：对羟基苯甲酸甲酯21.5g；对羟基苯甲酸丙酯8.6g，75%乙醇10ml）等，所用的消毒剂品种与使用要进行有效性验证方可使用，并定期更换消毒剂的品种）擦拭操作台及可能污染的死角 6.消毒要求：无菌室每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭或2%甲酚液或其他适宜消毒液（常用消毒剂的品种有：5—20倍稀释的碘伏水溶液、0.1%新洁尔灭溶液、1：50的84消毒液、75%乙醇溶液、3%碘酒溶液、5%石炭酸（来苏儿）消毒溶液、2%戊二醛水溶液、尼泊金乙醇消毒液（处方：对羟基苯甲酸甲酯21.5g；对羟基苯甲酸丙酯8.6g，75%乙醇10ml）等，所用的消毒剂品种与使用要进行有效性验证方可使用，并定期更换消毒剂的品种）擦拭操作台及可能污染的死角

方法是用无菌纱布浸渍消毒溶液清洁超净台的整个内表面、顶面、及无菌室、人流、物流、缓冲间的地板、传递窗、门把手。清洁消毒程序应从内向外，从高洁净区到低洁净区。逐步向外退出洁净区域。然后开启无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1—2h，以杀灭存留微生物。在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌30min。方法是用无菌纱布浸渍消毒溶液清洁超净台的整个内表面、顶面、及无菌室、人流、物流、缓冲间的地板、传递窗、门把手。清洁消毒程序应从内向外，从高洁净区到低洁净区。逐步向外退出洁净区域。然后开启无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1—2h，以杀灭存留微生物。在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌30min。

7.其他要求：如遇停电，应立即停止实验，离开无菌室。关闭所有电闸。重新进入无菌室前至少开启机房运转1h以上。 7.其他要求：如遇停电，应立即停止实验，离开无菌室。关闭所有电闸。重新进入无菌室前至少开启机房运转1h以上。

洁净度检查 无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数，以此来判断无菌室是否达到规定的洁净度，常有沉降菌和浮游菌测定方法。

沉降菌检测方法及标准： 以无菌方式将3个营养琼脂平板带入无菌操作室，在操作区台面左、中、右各放1个；打开平板盖，在空气中暴露30min后将平板盖好，置32.5℃士2.5℃培养48h，取出检查，3个平板上生长的菌落数平均小于1个。

浮游菌检测方法及标准： 用专门的采样器，宜采用撞击法机制的采样器，一般采用狭缝式或离心式采样器，并配有流量计和定时器，严格按仪器说明书的要求操作并定时校检，采样器和培养皿进入被测房间前先用消毒房间的消毒剂灭菌，使用的培养基为营养琼脂培养基或药典认可的其他培养基。使用时，先开动真空泵抽气，时间不少于5min，调节流量、转盘、转速。关闭真空泵，放入培养皿，盖上采样器盖子后调节缝隙高度。置采样口采样点后，依次开启采样器、真空泵，转动定时器，根据采样量设定采样时间。全部采样结束后，将培养皿置32.5℃士2.5培养48h，取出检查，浮游菌落数平均不得超过5个/m3。

每批培养基应选定3只培养皿做对照培养。无菌操作台面或超净工作台还应定期检测其悬浮粒子，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪）检测，并根据无菌状况必要时置换过滤器。每批培养基应选定3只培养皿做对照培养。无菌操作台面或超净工作台还应定期检测其悬浮粒子，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪）检测，并根据无菌状况必要时置换过滤器。

定期进行洁净度再验证 定期（每季度、半年、1年）或当洁净室设施发生重大改变时，要按国家标准GB/T16292-16294-1996《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》进行洁净度再验证，以确保洁净度符合规定，保存验证原始记录，定期归档保存，并将验证结果记录在无菌室使用登记册上，作为实验环境原始依据及趋势分析资料。并定期对洁净室的环境检测数据进行趋势分析和评估，根据评估结果，了解洁净室设施环境质量的稳定状况及变化趋势，决定是否有必要修订相应的警戒和纠偏限度。

定期更换新的紫外灯管、更换净化系统的零部件定期更换新的紫外灯管、更换净化系统的零部件定期（至少每年1次）更换新的紫外灯管，以确保紫外灯管灭菌持续有效。并同时在使用登记本上做好更换记录，定期归档保存。至少2年1次，或按洁净度验证实际情况，定期更换初效、中效、高效头。以确保净化系统的功能持续有效，并同时在使用登记本上做好更换记录，定期归档保存。

使用过程中应尽可能减少人员的走动或活动 • 平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，同向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。

洁净度不符合规定时立即停止使用 • 发现洁净度不符合规定时，应立即停止使用，寻找原因，彻底清洁、必须经洁净度再验证符合规定后，才再使用，并同时将情况记录在无菌室使用登记册上，定期归档保存。

对进入的外来人员或维修人员进行指导和监督 • 非微生物室检验人员不得进入洁净室（无菌室），对必须进入的外来人员或维修人员要进行指导和监督。

洁净室（无菌室）的日常管理 • 建立安全卫生值日制度，一旦发现通风系统、墙壁、天花板、地面、门窗及公用介质系统等设施有损坏现象，要及时报告并采取相应的修复措施，并保存记录及时归档。从洁净室（无菌室）环境中检测到的微生物应能鉴别至属或种，保留鉴别实验原始记录及菌种，作为无菌生产、无菌检查洁净室环境质量、消毒剂有效性评估及污染源调查的依据，并且也是为无菌检查阳性结果的调查提供第一手资料。

毒菌种处理和局部100级控制室 微生物检测实验室 • 对标准菌种进行各种处理 • 所检测的菌种进行各种处理 • 对培养基灵敏度检查 • 阳性对照用菌株的接种 • 抗生素效价测定用菌种的制备等 • 对样品中检出的或从洁净环境中分离到的微生物进行分类鉴别 • 有些实验还要自制生物指示剂

这些主体活动就直接要接触处理微生物菌种，如果菌种控制或操作不当，会导致实验室环境污染或菌种间交叉污染。这些主体活动就直接要接触处理微生物菌种，如果菌种控制或操作不当，会导致实验室环境污染或菌种间交叉污染。因此，菌种处理和微生物鉴别室必须与其他的微生物检查用洁净室严格分开。

通常应是由1个半无菌操作间和1个缓冲间组成的无菌室设施。室内安装灭菌紫外灯。按实验微生物性质的需要保持对该室的相对正压或相对负压。半无菌操作室的洁净度要求为10000级，净化层流台作为操作时的局部要求为100级洁净度，必要时，可改用生物安全柜内进行，有关微生物暴露性操作活动尽可能在生物安全柜内进行。通常应是由1个半无菌操作间和1个缓冲间组成的无菌室设施。室内安装灭菌紫外灯。按实验微生物性质的需要保持对该室的相对正压或相对负压。半无菌操作室的洁净度要求为10000级，净化层流台作为操作时的局部要求为100级洁净度，必要时，可改用生物安全柜内进行，有关微生物暴露性操作活动尽可能在生物安全柜内进行。

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