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文献汇报

文献汇报. 冀峰 2013-6-8. 汇报内容. 抗蛋白方面的一些基础知识 抗蛋白方面文献 几种糖的基本性质. 蛋白质分子的结构. 一级结构：是指蛋白质分子中氨基酸的 连接方式和排列顺序 。 二级结构：多肽链主链骨架中的 若干肽段（不涉及侧基） ，他们各自沿着某个轴盘旋或者折叠，并以 氢键 维系，从而形成有规则的构象。如  - 螺旋 (  -helix )  - 折叠 (  -pleated sheet ) ，  - 转角 (  -turn ) ，无规卷曲 ( random coil ) 等 。.  - 螺旋.  - 转角.

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  1. 文献汇报 冀峰 2013-6-8

  2. 汇报内容 • 抗蛋白方面的一些基础知识 • 抗蛋白方面文献 • 几种糖的基本性质

  3. 蛋白质分子的结构 • 一级结构：是指蛋白质分子中氨基酸的连接方式和排列顺序。 • 二级结构：多肽链主链骨架中的若干肽段（不涉及侧基），他们各自沿着某个轴盘旋或者折叠，并以氢键维系，从而形成有规则的构象。如-螺旋 (  -helix ) -折叠 ( -pleated sheet )，-转角 ( -turn )，无规卷曲 ( random coil )等。 -螺旋 -转角 -折叠

  4. C端 N 端 • 三级结构：是指多肽链在二级结构的基础上，由于其顺序上相隔较远的氨基酸残基侧基链的相互作用而进行长范围的盘旋和折叠，产生的特定的很不规则的立体结构。 • 四级结构：具 有两条或者两条以上的具有完整三级结构的多肽聚链聚合而成的特定构象的蛋白质分子。 三级结构 蛋白质在水中的构象：多为内含疏水核外包亲水壳的的球状或者椭球状的紧密 构象。

  5. 蛋白质的等电点 • 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 • 如果pH>等电点，则蛋白质整体带负电。 • 如果pH<等电点，则蛋白质整体带正电。 • 例如纤维蛋白原的等电点为5.2~5.6。溶菌酶是 11.0~11.35。在生理条件（pH=7.4）下，纤维蛋白是作为静电荷为负电荷的蛋白质，溶菌酶是作为静电荷为正电荷的蛋白质。

  6. 材料的亲疏水性是材料是否吸附蛋白质的一个关键因素材料的亲疏水性是材料是否吸附蛋白质的一个关键因素 • 当蛋白质与疏水表面接触时,表面与蛋白质的疏水部分作用力很大,为了达到热力学的稳定性,蛋白质的三级结构就会发生变化。蛋白质表面甚至内部的疏水以及低极性的基团将会吸附在材料的表面,这是是自发的过程，水表面便会发生不可逆的变性吸附，生物活性丧失。 • 在强亲水的表面,蛋白质与表面的相互作用较弱,蛋白质仍然以其离子性结构与表面接触,而本身构象不变。蛋白质在这一类的表面上吸附则是可逆吸附,构象不变、生物活性不会丧失。

  7. 抗蛋白类物质 氢键类 正负电荷类 丝氨酸 一些负电荷类 肝素

  8. 抗蛋白材料的抗蛋白机理 • 位阻排斥理论(主要用来解释表面接枝长链PEG) • 水化层理论（主要用来解释表面接枝短链PEG和两性离子类） • 维持天然构象

  9. 位阻排斥理论 protein protein H2O H2O H2O H2O PEG H2O H2O H2O H2O H2O H2O 熵减 该理论对接枝短链的PEG(例如几个重复单元)同样具有抗蛋白性 质没法解释，因为短链PEG构象改变的自由度本身就低。 PEG类材料的缺点：容易过渡金属等氧化。

  10. 水化层理论 理论内容：抗蛋白材料能与水分子通过氢键（含O或者N）或者强的极性离子 (阴阳离子)形成一个厚的水化层，水化层中的水的存在形式与本体中水的存在形式有所不同，而蛋白质分子为了维持其高级结构，也需要与水分子形成氢键，这样蛋白质分子表面也会形成一层水化层。如果蛋白分子要吸附到材料表面，必须取代材料表面的水化层，这在能量上是不可行的。

  11. 维持天然构象 • 维持天然构象理论：只要表面分子结构能够维持生物大分子及其组 • 合体的正常构象，则材料不仅具有抗凝血性，而且具有血液相容性 • 和生物相容性。 • 例如：高分子链结构的水溶性PEG 和两性离子的抗蛋白吸附性之所 • 以具有优异的防污性能，是因为在蛋白质与其组装体的表面离子作 • 用力小，并且在热力学上不会进入蛋白分子多级结构的内部，从而 • 有利于蛋白质维持天然构象。

  12. HEMA • 文章思路：水化层在nonfouling材料中占有重要作用，本文选择三种水化能 • 力不同的单体，尝试验证其抗吸附能力是否有显著差异。 • 结论:上述假想成立，其中HEAA在没有稀释的血浆中，能够在1h内蛋白吸 • 附量<0.3ng/cm2 （nonfouling定义为<0.5ng/cm2） HPMA HEAA HEMA 引发剂

  13. 光引发剂659

  14. 表征手段 • 凝胶的平衡含水量与非冻结水含量的测量 • SA(水杨酸)在水凝胶中的负载与释放 • ELISA测量蛋白的吸附量 • 材料表面细菌的粘附与本体中的细菌的抑制增长实验

  15. 凝胶的制备与表征 4mM单体 10mg光引发剂 不同比例的交联剂 溶解到溶剂中 冰浴中超声分散 混合溶液 防止提前反应 去离子水浸泡除去没有反应的单体 362nm，1h,室温 取出凝胶 • 表征 • 公式：EWC (%) = (ms− md)/ md • DSC测量非冻结水的含量（测试条件：室温降到-100℃，再升温到40℃，速率5℃/min,氮气流25ml/min） 光引发剂659

  16. 聚合物中水的三种不同存在形式 • 非冻结水：在温度降低到-100℃也不会结晶。 • 冻结水：低于0℃结晶。 • 自由水：在0℃结晶。

  17. 随着含水量的增加，非冻 结水的含量也是增加的 每一个重复单元键 合水的能力不同 Wnonfreezable=wnonfreezable/wpolymer=(EWC−wfreezable)/wpolymer （得到1g聚合物带有多少g非冻结水） wfreezable= Δ Hf/Δ Hw Nw= W非冻结(Mp/Mw) （得到1个重复单元带有多少个非冻结水） Nw= Wnonfreezable(Mp/8Mw) 其中，MW=18，MP=重复单元的摩尔质量

  18. 抗蛋白吸附实验（Fg） 5.6−6.5, 6.5 −7.1, 8.3 −10.2% ELISA检测

  19. 细胞的粘附实验 结论：支持凝胶表面如果没有蛋白的粘附，也能够有效地阻止细胞的粘附这一 假说 。

  20. Antimicrobial Activity of PolyHEAA Hydrogels 295nm When the concentration of SA was increased from 3.4 to 34% (w/v), the loading efficiency of SA incorporation was ∼ 20 and ∼ 80% (w/w), respectively. 285nm

  21. Antimicrobial Activity of PolyHEAA Hydrogels

  22. Antimicrobial Activity of PolyHEAA Hydrogels

  23. 结论 • 合成了一种polyHEAA/ SA水凝胶，水凝胶具有双功能性。 • 通过细菌实验，我们发现这种复合水凝胶在1天内对大肠杆菌与金黄色葡萄球 • 菌的杀菌能力非常强。 • 杀菌物质SA的引入，并没有影响水凝胶的nonfouling性质。

  24. 2013 • Introduction: • 对于外来植入人体的材料，细菌的粘附以及随后的增殖往往是导致植入材料失败的关键因素。 • 如果只是在材料上键接杀菌剂，则随着细菌的杀死，细菌会粘附在材料上，会包埋杀菌剂的功能基团进而影响杀菌效果。 • 如果只是在材料上键接两性离子聚合物，可以防止细菌粘附，但是不能阻止细菌在水化层附近以及本体中的增殖。

  25. 文章思路

  26. CBSA单体的制备流程与水解速率测定 水解测定条件：20℃，将单体溶解于PBS的重水溶液中，隔一段时间测定核磁，利用SA中羧基质子氢强度的变化来测定(其中质子的化学位移在酯键的水解过程中从7.63移动到7.72)。

  27. 三种类型水凝胶的制备与水解速率的测定 20ul 1173光引发剂 30ul EGDMA 1mL甲醇 1mol/LCBMA溶液 1mmol CBMA单体 倒在间距是0.76mm的载玻片中间 波长302nm的紫外光辐射2h 混合溶液 CBMA凝胶 光引发剂结构式： • CBMA-1-C2 SA操作同上 • CBSA只需将溶剂换成DMSO

  28. 三种类型水凝胶的水化操作 室温，水中或者水杨酸钠溶液中，24h CBMA-2水凝胶 4℃，pH=4, 24h CBMA-1-C2 SA水凝胶 4℃，pH=4, 24h CBSA水凝胶 • 三种类型水凝胶的水解操作 切成5mm直径，1mm厚的形状 三种水化后的水凝胶 隔一定的时间取出1mLPBS溶液做HPLC 20℃，10mL的PBS溶液，90rpm 并向原溶液补充1mL新鲜的 PBS溶液

  29. 三种类型的水凝胶的水解曲线 The cumulative drug release of three hydrogels each representing a typical controlled release mechanism : SA infused PCBMA-2 hydrogel (free diffusion); PCBMA-1-C2 SA hydrogel (electrostatic interaction) and PCBSA (hydrolyz able covalent bonding). The experiments were carried out under pH 7.4, 20℃and 90 rpm shaking.

  30. 蛋白（纤维蛋白原）吸附测试 浸入1ml 0.1mg/mLFITC标记的Fg的PBS溶液 PBS缓冲溶液洗三次 Hydrated hydrogel 1次2min 室温，30min 用相机拍摄水凝胶 表面的荧光强度 取出凝胶 PBS清洗表面游离的Fg

  31. Bacteria surface adhesion test 浸入PBS溶液10min后取出 浸入1ml金黄色葡萄球菌溶液（OD600近似是1） hydrogel 室温，60rmp,2h 在PBS溶液中轻轻振荡10min BacLight bacterial staining kit for 10 min 取出凝胶 相机观察表面的细菌细胞强度 • Bacteria growth inhibition test 取100ul溶液 浸入1ml金黄色葡萄球菌溶液（OD600近似是0.001) hydrogel 16h, 37℃ OD600 reading

  32. 细菌实验结果 (a) Bacterial surface adhesion on PCBSA, PCBMA-1-C2 SA, PCBMA-2 hydrogels as well as on the polystyrene control surface. The four surfaces were subject to bacteria S. epidermidissuspension in PBS (OD600 ~0.1) at room temperature and mild shaking condition for 2 h before visualization. (b) The growth inhibition of PCBSA, PCBMA-1-C2 SA and PCBMA -2 hydrogels against S. epidermidis. The supernatant OD600 reading was recorded 16 hafter initial inoculation as an indication for bacteria bulk density

  33. Introduction: • HEMA： • chemical stability, good biocompatibility • hydrophilic character • excellent mechanical properties • low level of immunogenicity • Moderare wetting,lower than natural tissues Zwitterions: • Poor mechanical properties • limited resistance to proteins 本文章讲二者结合起来，使水凝胶同时具备优良的机械强度，与天然组织类似的含水量 （天然组织含水量61%），同时具有较好的抗蛋白吸附能力。

  34. 凝胶中两性离子单体选择的依据 乙醇清洗 氮气流干燥 Gold coated substrates 紫外臭氧净化 (1mM引发剂溶液，室温24h) 在基体中接入两性离子聚合物分子刷 研究血清的吸附性 各种单体

  35. 几种类型凝胶的制备 光引发剂 苯偶姻乙醚 交联剂 二甲基丙烯酸乙二醇酯 0.5 wt %交联剂 0.5 wt %光引发剂 避光，4℃，搅拌至完全溶解 单体按照上面表格的比例 单体混合溶液 浸泡在去离子水中除去未反应的单体 紫外照射30min 倒入两个玻璃片之间 凝胶 12h换一次水，浸泡8天

  36. 凝胶的表征手段 • FTIR-ATR • EWC • 机械性能 • 对血浆的抗吸附性 1654 1609 1558 1654 1558 1500 1900 1700 1600 1800 Amidic region of the FTIR-ATR spectra of hydrogels of (a) poly (HEMA -co - CBAA-3 ) and (b ) pol y(HEMA-co - CBMAA -3) for different concentration of the zwitterionic monomer: (1) 0%, (2) 1%, (3) 5%, (4) 7.5%, and (5) 10%.

  37. 凝胶平衡含水量的测量 去离子水泡5d 湿凝胶重ms 干凝胶md 公式：EWC (%) = (ms− md)/ md

  38. 机械性能测定 两种两性离子结合水的能力有所不同 测试条件：凝胶在水里泡10d, 室温，样条35 mm长，2 mm 宽（最窄处）,1mm 厚，速度 1mm/ min

  39. 水凝胶在血浆中的吸附实验 1648 1545 减少50% 减少40% 减少65% 减少70% 减少90% 减少95%

  40. 在低浓度溶解度可以，当浓 度稍微大一点，溶解性变差。 思路 合成两性离子类的交联剂， 可以增加结构的均一性 增加水化层的连续性。进 而可能会对蛋白或者细胞 的吸附产生影响。并且可 以通过增加其用量来提高 凝胶的机械强度。

  41. 交联剂的制备路线

  42. 凝胶的制备 要保证两种水凝胶中的单体与交联剂的总个数是一样的 在1 M NaCl中配置单体质量浓度为65% 引发剂：过硫酸铵，亚硫酸钠 MBAA交联剂的用量2 to 23%（占单体的摩尔分数） CBMAX 交联剂的用量一直做到75% 在PTFE载玻片中间，温度为60℃，使其反应生成凝胶

  43. 纤维素 缺点：纤维素溶解性不好（纤维素分子内的大量氢键被占用使之相应减少了与水 分子之间形成氢键的能力，因而纤维的含水量很低）

  44. 卡拉胶 卡拉胶的分类 在水溶液中，在 的存在下，可以形成热可逆凝胶 在任何情况下都不能形成凝胶

  45. 凝胶化机理 在 热可逆凝胶化的理论研究中，。所谓“二步”机理是指 热可逆凝胶化过程分两步完成：第一步“线团到螺旋” ；第二步“聚集到凝胶化。不过对于 在凝胶化过程中，由线团到螺旋这一步中，形成的螺旋是单还是双的问题尚存在完全对立的观点。 双螺旋机理 • 化学稳定性 • 卡拉胶在中性和碱性介质中即使加热也不易水解，但在酸性介质，尤其pH<4 以下，容易发生酸水解作用。加热使水解更快，大分子降解为小分子，使粘度下降，失去凝固性。室温下，凝胶状态卡拉胶抵抗酸水解的性能好于溶解态的，这是由于在凝胶状态 时，卡拉胶分子是比较规则紧密的 三维网状结构，对糖苷键起到庇护作用，减低了它被酸水解的过程。

  46. 功能 • 保水剂，增稠剂，胶凝剂 • 抗病毒活性 • 抗凝血

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