第八章原生质体培养宜职院 08.9

第八章原生质体培养 宜职院08.9

目的与要求 掌握植物细胞原生质体培养的意义，了解原生质分离方法，原生质纯化方法和活力测定方法。掌握植物原生质体的培养方法及其特点，以及存活率、密度、产量的测定方法。掌握原生质体融合概念、介绍原生质体融合方法，了解杂种细胞的筛选、鉴定和杂种植株的鉴定方法。具备原生质体分离、纯化基本认知，具有原生质体培养基本能力，能够理解原生质体融合概念及方法。

一、原生质体概念 原生质体：原生质体去掉细胞壁的由质膜包裹着的裸细胞。二、原生质体培养意义： 1、原生质体没有细胞壁，有利于细胞融合，体细胞杂交，基因转移和单细胞培养。 2、原生质体能比较容易摄取外来的遗传物质，作为理想的受体系统进行各种遗传操作的研究，实现体细胞杂交在植物遗传育种方面的应用。

第一节原生质体的分离与纯化 一、原生质体的分离（一）材料来源叶片，花瓣，果实组织，花瓣髓部，子叶等，尤其是叶肉细胞及由各部分形成的培养细胞和悬浮细胞。

（二）分离方法 1、机械分离法产生质壁分离——释放原生质体缺点：原生质体的产量很低；方法繁琐费力；因必须高度质壁分离，故局限性大。优点：能够排除外加酶对离体原生质体的结构和代谢活性的有害影响。

2、酶分离法 收率高、活力强、完整性好。分离原生质体最有效。（1）酶的种类及特点分离原生质体的酶多是一些复合酶制剂，以其所含的主要酶的作用分为： 1、纤维素酶类 2 半纤维素酶类 3 果胶酶类 4 崩溃酶 5 蜗牛酶

（2）酶液的配制 1、酶的配比和浓度 2、渗透压和稳定剂及PH。

（3）分离原生质体 1、两步分离法。用果胶酶离析植物组织，收集细胞，经洗涤后用纤维素酶解离细胞壁，然后获得原生质体。 2、一步分离法。一定量的纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理。

叶肉原生质体分离纯化

纯化后的叶肉原生质体

二、原生质体的纯化与活力测定 （一）原生质体的纯化 1、离心沉淀法 2、漂浮法 3、界面法（二）原生质体活力的测定： 1、形态识别形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的原生质体即为存活的。 2、染色识别用0.1%酚番红或Evans蓝进行染色。

第二节原生质体培养 一、培养基 1、碳源：葡萄糖 2、氮源：谷氨酰胺 3、生长物质：生长素与细胞分裂素 4、钙源：可增强稳定性，提高分裂频率，明显改变细胞质内外的离子交换。 5、渗透压：高渗溶液，培养时一般逐步过渡，通常的渗透剂是甘露醇和山梨醇。 6、PH5.6～6.0，醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌

原生质体培养程序示意图

二、培养方法 1、液体浅层培养原生质体（约2×105/ml密度）悬浮在液体培养基—将悬浮物质移到直径为60cm的平皿中（2-3mm为宜）—5-10天后开始原生质体分裂特点：通气好，原生质体代谢物易扩散，防止有害物质积累过多造成毒害，转移添加新鲜培养基方便，便于观察和照相。操作简单，可微量培养，细胞植板率高。但原生质体沉淀，分布不均，细胞团聚集多，难成单细胞株系。

2、平板法培养 原生质体（密度为4×105/ml）与等量体积琼脂糖培养基均匀混合—置于6cm培养皿（2-3mm）,暗培养—5-7天原生质体开始分裂特点：原生质体分布均匀，利于分裂，容易获得单胞株系，可定位观察。原生质体易受热伤害，易破碎，原生质体始终处于高渗透压胁迫下生长发育缓慢，植板率低。

3、悬滴法培养 将含一定密度原生质体的悬浮液，滴在6cm培养皿盖内侧上，皿底加入培养液和渗透剂等液体保湿，此时培养小滴悬挂在皿盖内。特点：用材少，培养液消耗少，利于通风与观察，可做原生质体不同密度的培养对比试验，进行单细胞培养。

4、双层培养法 固体培养和液体培养浅层培养相结合的方法，效果最佳。原生质体采用平板培养方法包埋在培养皿底层，上面再加入相同成分的液体培养基，暗培养。需更换新鲜液体培养基。特点：原生质体分布均匀，有利于分裂，易获单细胞株系，能除去抑制分裂的有害物质，细胞植板率高。原生质体易受热伤害，易破碎。

5、饲喂培养法 将饲喂的细胞用培养基作平板，此平板称饲喂层，用X射线或紫外线照射，使核失活但细胞存活，然后将原生质体以液体浅层培养或平板技术铺在饲喂层上。特点：以一种植物细胞制成的平板，支持另一种植物原生质体的生长。饲喂层没有种的特异性。

三、培养条件25-27℃，光照16h/d，最初几天经常摇动，以助透气。四、原生质体存活率、密度及产量的测定（一）双醋酸盐荧光素染色法测定存活率 存活率=存活原生质体数/总原生质体数×100%（二）测定原生质体的密度原生质体的密度（个/ml）=（原生质体数/1区域）×104×稀释倍数

（三）原生质体产量的测定Y=DV / FWY（个/g）——原生质体产量D（个/ml）——存活原生质体密度V（ml）——制备所得原生质体悬液的总体积FW（g）——制备原生质体所用材料的鲜重

第三节原生质体融合 也称体细胞杂交，就是分离下来的不同亲本杂交的原生质体，在人工控制下，像性细胞受精作用那样互相融合成一体。自然条件下，原生质体自然融合频率极低，必须加以一定的方法诱导，才能促进原生质体的融合。

原生质体融合

甘薯原生质体融合植株

二、原生质体融合的方法和过程（一）无机盐诱导融合 硝酸钠（二）聚乙二醇（PEG）诱导剂与高钙相结合的诱导融合1、PEG诱导剂溶液配制：分子量为4000-6000。2、高Ca2+-高PH液3、原生质体培养基：NT与MS

4、融合过程 （1）收集原生质体（2）滴150ul混合双亲的原生质体悬浮液于载体玻片上，形成一层薄层。（3）吸取PEG融合诱导液450u ,使PEG溶液逐渐与原生质体接触，促使原生质体相粘连。（4）保温后，取高Ca2+-高PH溶液0.5ml，滴入原生质体悬浮液与PEG混合液中。

（5）吸取2ml原生质体培养基洗涤PEG处理过的原生质体5次。（5）吸取2ml原生质体培养基洗涤PEG处理过的原生质体5次。（6）在载玻片上的材料上，加上一层原生质体生长所须的培养基（7）融合百分率计算融合百分率=融合数目/两亲本原生质体总数×100%

完整洋葱原生质体（40×） 完整烟草原生质体（40×）

（三）电融合技术 1、将原生质体悬浮液离心，去上清，用电击液（10%甘露醇，0.1mmol/L醋酸钙，0.5mmol/L醋酸镁） 2、对电融合仪的交变电场频率，高压方波幅值和持续时间、次数、间隔时间进行预先设置试验。 3、取1-2滴悬浮液与电融合仪极间。 4、1-2min后，给予瞬间的高度电脉冲。

三、杂种细胞的筛选与鉴定 （一）互补筛选 1、白化互补选择法 2、营养缺陷型互补选择 3、抗性互补选择 4、代谢互补仰制选择（二）机械分离杂种细胞法法（三）双荧光标记选择法

双荧光素标记

作业： 1、说明机械分离法和酶分离法的特点 2、原生质体纯化方法有哪些？原生质体活力的测定方法有哪些？ 3、简述原生质体五种培养方法及特点 4、原生质体融合有哪几种方法？

四、杂种植株的鉴定 1、形态学鉴定 2、细胞学观察 3、DNA内切图谱分析法 4、同工酶分析法

思考题： 1、说明机械分离法和酶分离法的特点 2、原生质体纯化方法有哪些？原生质体活力的测定方法有哪些？ 3、简述原生质体五种培养方法及特点 4、原生质体融合有哪几种方法？

第八章原生质体培养宜职院 08.9