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06 DNA 鑑定原理及運用

06 DNA 鑑定原理及運用. 刑事警察局法醫室 聯絡電話 : (02)27569224. 法醫室 組長 柳國蘭 組員 呂政鴻. 刑事鑑識的專業內涵. 刑事血清學 刑事病理學 刑事人類學 刑事昆蟲學 刑事毒物學 刑事攝影學 文書鑑定 槍彈及工具痕跡. 指紋鑑定 影像處理 火災及爆炸物處理 DNA 鑑定 現場重建. DNA 在哪裡呢 ?. 動物細胞：細胞核 ( 染色體 ) 、粒線體. 動物細胞. 粒線體. 染色體. DNA 在哪裡呢 ?. 植物細胞：細胞核 ( 染色體 ) 、 粒線體、葉綠體. 葉綠體. 染色體. 粒線體.

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06 DNA 鑑定原理及運用

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  1. 06 DNA鑑定原理及運用 刑事警察局法醫室 聯絡電話: (02)27569224 法醫室 組長 柳國蘭 組員 呂政鴻

  2. 刑事鑑識的專業內涵 • 刑事血清學 • 刑事病理學 • 刑事人類學 • 刑事昆蟲學 • 刑事毒物學 • 刑事攝影學 • 文書鑑定 • 槍彈及工具痕跡 • 指紋鑑定 • 影像處理 • 火災及爆炸物處理 • DNA鑑定 • 現場重建

  3. DNA在哪裡呢? • 動物細胞：細胞核(染色體)、粒線體 動物細胞 粒線體 染色體

  4. DNA在哪裡呢? • 植物細胞：細胞核(染色體)、 粒線體、葉綠體 葉綠體 染色體 粒線體 植物細胞

  5. DNA是遺傳物質 父親的精子 母親的卵 1.每個人細胞中的DNA都是相同的。(血液中的DNA與在皮膚細胞、精液及唾液都是相同的) 2.除同卵雙生子外，理論上，不可能有二個人DNA組成完全相同 3.人類共有23對染色體（22對體染色體與1對性染色體--X、Y）。一條染色體來自父親,另一條來自母親。所以細胞核之DNA組成一半來自父親一半來自母親 小孩的細胞

  6. DNA序列的變異? • 除同卵雙胞胎外之任兩人間，其大部分的DNA分子都相同(99.7%)，僅小部分的DNA分子相異。 • DNA序列鑑別的方法 序列多型性: 5’----AGACTAGACATT----3’ 5’----AGATTAGGCATT----3’ 長度多型性: 5’--(AATG)(AATG)(AATG)--3’ 5’---(AATG)(AATG)--------3’ 應用於SNP,粒線體 應用於STR鑑定 allele的數目至少2個就稱該基因具多型性

  7. 重 複 DNA 序 列 • 約佔人類基因體(genome)之20-30 %。 • 概分為二類： • 相連重複序列 (10%) • 分散重複序列 (15-20 %) 每個重複單位有長的序列,也有短的序列 ATCG ATCG ATCG ATCG ATCG ATCC ATCC ATCC ATCC

  8. 何謂DNA-STR型別?Short Tandem Repeats (STRs) STR(即短的相連重複序列)-每個重複單位之長度為2-7 核甘酸 (or 1-4 bp), 1 2 3 4 5 6 5’-TTTCCC TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCACCATGGA-3’ 3’-AAAGGG AGTA AGTA AGTA AGTA AGTA AGTA AGTGGTACCT-5’ 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4 5 5’-TTTCCC TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCACCATGGA-3’ 3’-AAAGGG AGTA AGTA AGTA AGTA AGTA AGTGGTACCT-5’ 5 4 3 2 1 這就是THO1基因位 的DNA-STR型別 THO1 5,6

  9. 染色體DNA-STR型別 他的兩條染色體在THO1基因位都是重複7次,型別為7,7(同型合子) 人與人之間的相連重複次數是不同的 5 6 他是型別是12,13(異型合子)

  10. 目前使用穩定的商用鑑驗盒進行分析 • 國內外研究論文已發現約2000多個具多型性的STR基因位 • 世界各國大都使用商用鑑定盒進行DNA-STR型別檢測 (例如Powerplex16,Cofiler, Profiler,Identifiler) • 本局使用Identifiler(包含15組STR及一組性別基因)

  11. DNA-STR型別 XX 性別決定基因

  12. 親子遺傳法則 父親的精子 母親的卵 父親的精子 母親的卵 父親的型別 小孩的型別 小孩的細胞 小孩的細胞 母親的型別

  13. 親子遺傳法則 一個家庭的3個小孩DNA-STR型別可能不同,最多可能有四種 父親 11,14 8,12 母親

  14. 形成具個化力之DNA指紋 • 人類共有23對染色體（22對體染色體與1對性染色體--X、Y）。

  15. Y染色體DNA-STR Y染色體上STR位置 • 僅男性才具有 • 父系基因遺傳 • 同父系血緣男性,若無突變發生, Y-STR型別應該相同

  16. Y STR鑑定

  17. 粒線體DNA(一)

  18. 粒線體DNA(二) 1.高複製數目：粒腺體是細胞內的小胞器，具有少量DNA，但1個細胞中含有10～1000個粒腺體。 2.母系遺傳：粒腺體由母親傳給子女，應用母系血緣鑑定（如外祖母與孫女,兄弟姊妹) 3.DNA裂解的檢體：用於DNA-STR型別毀壞無法分析（如多年骨骸）。

  19. 序基多型(point/base polymorphism ) ….CCAGCT….. …….CCCGCT…… ..CC-GCT …. ….CCGGCT…. 在同一鹼基的位置上發生替代或缺失 粒線體鑑定是分析其高度變異區hv1及hv2之序列多型

  20. 粒線體之應用與限制 • 由於粒線體DNA定序技術比體染色體分析技術靈敏許多，研判上要小心。 • 粒線體DNA鑑定多為輔助性質，或在體染色體DNA鑑定無法成功時，以粒線體DNA鑑定的檢出優勢，提供重要的鑑定結果。 • 無名屍身分經姐妹或姐弟或兄妹指認時,需確認關係

  21. DNA鑑定於刑事鑑識之應用 (父系或母系鑑定) Lineage Markers 體染色體鑑定 經過基因重組 具高度鑑別力 DNA個化的鑑定/ 親子關係鑑定 Y染色體鑑定 父系遺傳 父系親緣關係鑑定 粒線體鑑定 母系遺傳 母系親緣關係鑑定

  22. 刑事DNA鑑定之主要特色 • 具個化能力且證明關連性： 「人」與「現場」的連結可證明到過現場 「人」與「行為」的連結可證明犯罪行為 • 現場證物種類很多 • 由微小的斑跡做出可靠的證據 • 證據經適當保存,10年後亦可鑑驗 • 數據化資料處理容易，可串聯連續案件 • 已獲得世界各國司法體系接受

  23. 證物種類 • 血液或血液斑 • 唾液 • 精液或精液斑 • 毛髮(毛囊細胞) • 組織 • 骨頭 • 牙齒 • 皮膚表面之脫落細胞 • 尿液 • 其他含有細胞之檢體…

  24. DNA證物來源 • 任何物件上沾留之血跡斑、組織或毛髮 • 被害人下體棉棒、內褲、胸罩 • 咬痕或舔的部位 • 指甲上微物 • 保險套（使用過）的內面與外面 • 衣物、口罩、衛生紙、毛毯、被單、枕頭、床單、帽子（安全帽）、絲巾、毛巾或其他類似擦拭物 • 煙蒂、檳榔渣、筷子、牙籤、牙線、飲料瓶(罐)或杯子的就口邊緣 • 膠帶、綑綁人的繩索繃帶、方向盤 • 其他

  25. DNA證物之來源、位置及限制

  26. 篩選斑跡 證物萃取DNA 證物DNA定量反應 參考檢體萃取DNA PCR反應 PCR反應 STR型別分析,與參考檢體比對或輸入資料庫 STR型別分析,與證物比對或輸入資料庫 證物鑑驗流程 實驗室鑑定流程 標準檢體鑑驗流程 個案比對結果或資料庫比對結果 比對後發現與某案或某建檔對象DNA相符或未發現相符者

  27. 證物DNA鑑定流程 找尋可疑斑跡 1.85ng 0.023ng 16.7ng DNA萃取 0.21ng 搜尋可疑斑跡 DNA定量 DNA萃取 5.56ng 0.068ng 0.62ng PCR複製 50ng DNA定量分析 分析PCR產物 結果判讀 多基因位PCR反應 資料建檔與搜尋 分析PCR產物 計算型別隨機 重複出現的機率 資料的建檔與搜尋 結果判讀

  28. DNA定性與定量 • 人類DNA定量及Y染色體DNA定量結果研判選擇最佳DNA鑑定方法並決定PCR反應之DNA模板量 • DNA定量結果為男女混合,若男女DNA含量比例懸殊(超過1比10者),因複製反應競爭關係,量微者STR型別通常無法驗出,若仍需檢出量微的男性型別,可直接進行男性Y染色體STR仍型別檢測 使用ABI 7900與7000系統進行real-time定量PCR

  29. 各類生物性跡證DNA含量情形 • 檢體種類 DNA含量 • 血液 20,000-40,000 ng/ml • 血斑(1 cm2) 約200 ng • 血斑(1 mm2) 約2 ng • 精液 150,000-300,000 ng/ml • 性行為後之陰道棉棒 0-3,000 ng • 毛髮 • 含毛囊(如用拔的) 1-750 ng/hair • 不含毛囊(如用剪的) 1-12 ng/hair • 唾液 1,000-10,000 ng/ml • 尿液 1-20 ng/ml 要成功進行DNA-STR型別分析,除了品質佳外,至少需約125ng/ml 1.一般皮膚脫落之表皮細胞多為無核之角質化細胞，故一般觸摸動作遺留之DNA非常微量，難以成功檢出DNA-STR型別。 2.一般汗液所含之細胞量亦很少 ，型別檢出率較低。

  30. PCR(聚合脢連鎖反應)複製技術 利用熱循環儀器之溫度 設定來進行複製反應 溫度上升到95度,雙股DNA分離 引子序列 溫度下降到55度,引子黏合 引子序列 溫度72度DNA延伸 28cycle 228

  31. 16個基因位同時複製

  32. 毛細管電泳分離 雷色偵測 ABI 3100 定序儀 依據DNA片段大小進行毛細管電泳分離 50分鐘內完成16個檢體電泳分析 DNA圖譜

  33. 利用DNA片段長短及螢光標記來分離 雷色偵測

  34. 相符的訊號

  35. 不相同(排除)的訊號

  36. 未檢出足資比對的訊號 信號不足時,無法研判型別

  37. 未檢出型別

  38. 混合型別之分析

  39. 比對標準品轉換為數據化型別 與標準品LADDER比對,透過商業軟體轉換為DNA-STR型別

  40. 個化鑑定

  41. 個化鑑定-鑑驗結果與結論 異型合子 型別重複出現的機率或可能性非常低,愈小愈好 同型合子

  42. STR基因型比對結果的四種可能 • 相符（Match）–STR基因比對結果參考樣品與證物基因型相同。 • 不排除（Inclusion）–STR基因為混合型,比對結果參考樣品基因型涵蓋在證物基因型中。 • 排除（Exclusion）–STR基因比對結果參考樣品與證物基因型不同，顯示兩檢體有不同的來源。 • 無法下結論（Inconclusive）–鑑定結果無法判斷基因型是否相符。(可能無結果)

  43. 親子鑑定 • 疑父 • 疑子 • 是否符合親子遺傳法則 • PI值計算 • 換算機率

  44. 需符合親子遺傳法則 父親的精子 母親的卵 父親的型別 父親的精子 母親的卵 小孩的型別 小孩的細胞 小孩的細胞 母親的型別

  45. 親子鑑定 • 機率(probability)與可能性(odds)

  46. 親子關係預估機率試算 若僅一組STR型不符合親子遺傳定律是無法排除其親子關係,因為可能是突變造成,固至少須兩組STR型別不符合親子遺傳定律,才可排除

  47. DNA證物檢出成功率

  48. DNA檢體怕什麼? • 乾燥 潮溼易使細菌滋生，破壞細胞及DNA • 防止腐敗 1.血液（液體）檢體需以4℃ 保存 2.組織、 骨頭等易腐敗之檢體以20 ℃冰存 3.一般乾燥後檢體應存放室溫、通風、乾燥及避免陽光紫外線處 怕濕 怕熱 怕光

  49. 生物跡證保存的要件 • 生物性跡証保存原則 • 乾燥、低溫的環境，避免日曬與潮濕環境 • 包裝 • 以紙袋包裝，不可使用塑膠袋與膠帶包裝，現場檢體需分別包裝，以免相互污染 • 封緘 • 須於紙袋外側進行封緘

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