Αρχές Μεθόδων Μοριακής Βιολογίας

1. Αρχές Μεθόδων Μοριακής Βιολογίας Βουλιάνα Βελετζά, Αναπλ. Καθηγήτρια Βιολογίας, Τμήμα Ιατρικής ΔΠΘ

2. Η Μοριακή Βιολογία, προϊόν της σύζευξης της Βιοχημείας με τη Γενετική παρέχει μια σειρά μεθόδων με ευρεία εφαρμογή σε όλες σχεδόν τις ιατρικές ειδικότητες και ιδιαίτερα στα λοιμώδη νοσήματα, τα κληρονομούμενα νοσήματα, τον καρκίνο κ.λ.π.

3. Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) • Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μέθοδος παραγωγής μεγάλου αριθμού αντιγράφων συγκεκριμένων μικρών αλληλουχιών DNA – λογαριθμική αύξηση • Βασίζεται στην ιδιότητα των αλυσίδων του DNA α) να αποχωρίζονται σε υψηλή θερμοκρασία και να επανενώνονται σε χαμηλότερη θερμοκρασία και β) να αντιγράφονται • Παράγονται εκατομμύρια αντιγράφων

4. Εφαρμογές PCR • Ανίχνευση DNA και RNA με τεράστια ευαισθησία  ανίχνευση ιών κ.α. μικροοργανισμών σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις • Ανίχνευση μεταλλάξεων

5. Κάθε τμήμα του DNA περιέχει δεδομένο αριθμό θέσεων περιορισμού που μπορεί να προσβληθούν από τα περιοριστικά ένζυμα • Τμήματα DNA που έχουν τις ίδιες περιοριστικές θέσεις είναι ίδια ή ομόλογα

6. Sequence digested with: EcoNI 380bp 700bp

7. Sequence digested with: AciI, BfaI 730bp 350bp

8. Ανεύρεση πρωτοταγούς δομής DNA • Sanger ενζυμική μέθοδος ddntp dntp

9. Παραλλαγές PCR • RT- PCR(reverse transcription PCR): για ενίσχυση RNA • Multiplex PCR • Nested PCR • Rep-PCR • AFPL assay • RAPD • Real Time PCR επιτρέπει: - ποσοτική εκτίμηση ανατύπων σε αρχικό διάλυμα και - ποσοτικοποίηση διαφορών στην έκφραση mRNA

10. Multiplex PCR- ταυτόχρονη ενίσχυση πολλαπλών στόχων Primer A/F-PrimerA/R Primer B/F-Primer B/R

11. Nested PCR A’ Pcr-736 bp 35 κύκλοι Nested Pcr-593 bp 35 κύκλοι M.tubercolosis

12. RT-PCR.Συνδυασμός της αντίστροφης μεταγραφής και της PCR • Το αρχικό υλικό είναι mRNA. • Χρησιµοποιείται για την παραγωγή αντιγράφων cDNA από mRNA. • Στο πρώτο βήµα χρησιµοποιείται ανάστροφη µεταγραφάση (σύνθεση πρώτου κλώνου) • Στο δεύτερο βήµα γίνεται σύνθεση του δεύτερου κλώνου.

13. RT-PCR •Κατασκευή βιβλιοθηκών cDNA(κυρίως όταν το αρχικό υλικό είναι πολύ σπάνιο) •Ανίχνευση µεταλλάξεων χωρίς κλωνοποίηση του γονιδίου •Ποσοτική µέτρηση της γονιδιακής έκφρασης

14. AFPL assayamplified fragment length polymorphism • Ενίσχυση περιοχής Χ με την PCR • Πέψη με ενδονουκλεάσεις περιορισμού • Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης

15. RAPD • Τυχαίοι primers • 9-10 βάσεις • Χαμηλή θερμοκρασία προσκόλλησης Ο αριθμός και η θέση των τυχαίων περιοχών ενίσχυσης ποικίλουν σε διαφορετικά στελέχη του ίδιουείδους

16. PFGE • Καλλιέργεια του μικροβίου στο ζωμό • Πέψη του γονιδιώματος με σπάνιες ενδονουκλεάσεις περιορισμού • Ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο

17. -

18. Real Time PCR • Είναι η διαδικασία ενίσχυσης μιας DNA αλληλουχίας με τη μέθοδο της PCR και ταυτόχρονα της ανίχνευσης του παραγόμενου προϊόντος σε πραγματικό χρόνο καθ’όλη τη διάρκεια της αντίδρασης (Real-time PCR).

19. Βασικά στοιχεία για την εκτέλεση της Real-time PCR • Ειδικές χρωστικές που ενσωματώνονται στο προϊόν της αντίδρασης και εκπέμπουν φθορίζον σήμα που ανιχνεύεται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. • Ειδικά σχεδιασμένοι υποδοχείς δειγμάτων (τριχοειδή σωληνάρια) με άριστες οπτικές ιδιότητες για: • τη διεξαγωγή της αντίδρασης • και την ανίχνευση του εκπεμπόμενου σήματος Ταυτόχρονη ανίχνευση και ανάλυση των σημάτων φθορισμού από κάθε δείγμα.

20. Κινητική της αντίδρασης της PCR

21. SYBR Gr Αποδιάταξη Επανασύνδεση Επιμήκυνση Τέλος επιμήκυνσης SYBR Green l SYBR Green I SYBR Gr SYBR Gr SYBR Gr SYBR Gr

22. LC-640 φλουορεσκίνη Μεταφορά ενέργειας (F.R.E.T.) αποδιάταξη επανασύνδεση επιμήκυνση τέλος επιμήκυνσης Σεσημασμένοι ανιχνευτές υβριδισμού (Hybridization Probes)

23. Real-time PCR • Υψηλή ταχύτητα εκτέλεσης της PCR • Παρακολούθηση της αντίδρασης σε πραγματικό χρόνο (On-line and Real-time Fluorescence Monitoring) • Άμεσος χαρακτηρισμός προϊόντων με την ανάλυση του σημείου τήξης τους (Melting Curve Analysis) • Ταχεία και ακριβής ποσοτικοποίηση • Ελαχιστοποίηση κινδύνων επιμόλυνσης

24. Παρακολούθηση της PCR με τη χρήση SYBR Green I Ανάλυση Quantification Melting Curve Template: human genomic DNA; Target: β-Globin; Detection Format: SYBR Green I

25. Real Time PCR

26. Μέχρι πριν λίγα χρόνια οι Βιολόγοι μελετούσαν τα γονίδια και τις πρωτεΐνες κάθε ένα ξεχωριστά. • Στα γονίδια έγινε: Χαρτογράφηση Κλωνοποίηση & PCR Μεταλλαξογένεση Αλληλουχοποίηση Ανάλυση των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν

27. Έτσι μελετήθηκαν πολλά γονίδια • Πρόγραμμα ανθρώπινου γονιδιώματος 30.000 γονίδια • Γονιδιώματα άλλων οργανισμών (E.coli, Drosophila,ποντικού κ.λ.π.) • Για να γίνει εφικτή η εύρεση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων ολόκληρων γονιδιωμάτων επιστρατεύθηκαν αυτοματοποιημένοι μηχανισμοί

32. Humans, Homo sapiens; see Human genome project Neanderthal, "Homo neanderthalensis" (partial) Haemophilus influenzae, a bacterium (the first free-living organism to have its genome fully sequenced) Common House Mouse, Mus musculus Brown Rat, Rattus norvegicus Common ChimpanzeePan troglodytes; see Chimpanzee Genome Project Rhesus Macaque, Macaca mulatta Domestic Chicken, Gallus gallus Tammar Wallaby, Macropus eugenii Domestic Cat, Felis silvestris Domestic Dog, Canis lupus familiaris Common fruit fly, Drosophila melanogaster Baker's yeast, Saccharomyces cerevisiae Red bread mold, Neurospora crassa Thale Cress, Arabidopsis thaliana Rice, Oryza sativa Common Wheat, Triticum aestivum Maize, Zea mays Poplar, Populus trichocarpa (The first tree to have its genome fully sequenced) Escherichia coli, a coliform bacterium SARS virus Purple-spined sea urchin, Arbacia punctulata Caenorhabditis elegans, a nematode worm Zebra Danio, Brachydanio rerio African clawed frog, Xenopus laevis Oryzias latipes, a medakafish Tiger blowfish, Takifugu rubipres TomatoSolanum lycopersicum PotatoSolanum tuberosum Western Honey bee, Apis mellifera Grapevine, Vitis vinifera L. Spanish flu

33. Επιθυμητή η: - ταυτόχρονη μελέτη ΠΟΛΛΩΝ γονιδίων - ταυτόχρονη μελέτη ΟΛΩΝ των γονιδίων ενός οργανισμού

34. Genomics • Συστηματική μελέτη του συνόλου του γενετικού υλικού ενός οργανισμού (δομή και λειτουργία) • Εξετάζονται οι μοριακοί μηχανισμοί και η αλληλεπίδραση των γενετικών και περιβαλλοντικών παραμέτρων στις ασθένειες

35. Αν και κάθε κύτταρο ενός οργανισμού φέρει το ίδιο DNA… • Διαφορετικά γονίδια εκφράζονται σε κάθε διαφορετικό ιστό  διαφορετικά RNA • Ποιοτική και ποσοτική διαφορά

36. Συγκρίνοντας το προφίλ γονιδιακής έκφρασης διαφορετικών κυττάρων μπορούμε να διακρίνουμε κατά πόσον αυτά διαφέρουν μεταξύ τους

38. Μικροσυστοιχίες (microarrays) • Υπόστρωμα: μεμβράνη ή γυαλί • Προσδεδεμένα: ολιγονουκλεοτίδια ή cDNA • Προστιθέμενο: cDNA μάρτυρα + cDNA δείγματος

39. Κάθε μικροσυστοιχία αποτελείται από χιλιάδες spots. • Κάθε spot περιέχει πολλαπλά αντίγραφα μιας μοναδικής αλληλουχίας DNA που αντιστοιχεί σε ένα γονίδιο (1 spot – 1 γονίδιο) • Αν οι ανιχνευτές είναι cDNA: Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης με μικροσυστοιχίες cDNA • Μπορούμε να εντοπίσουμε διαφορές μεταξύ δύο ειδών κυττάρων, π.χ. καρκινικών κυττάρων vs.υγιών κυττάρων

43. Ανάλυση μικροσυστοιχιών

44. Με τις μικροσυστοιχίες μπορούμε να εντοπίσουμε ποια γονίδια εκφράζονται διαφορετικά σε δύο είδη κυττάρων • Δεν μπορούμε να εντοπίσουμε ποια γονίδια φέρουν μετάλλαξη η τι είδους βλάβη έχουν

45. Αριθμός αναφορών σε μικροσυστοιχίες DNA

46. SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)

49. HapMap • Παγκόσμιος οργανισμός με στόχο τη δημιουργία χάρτη που θα αντιπροσωπεύει τη διαφορετικότητα των ανθρωπίνων απλοτύπων. • Ο χάρτης θα περιγράφει τις πλέον συνήθεις γενετικές παραλλαγές στο ανθρώπινο γονιδίωμα. • Συνεργασία ερευνητών σε Πανεπιστήμια, μη κερδοσκοπικούς οργανισμούς και εταιρείες από Καναδά, Κίνα, Ιαπωνία, Νιγηρία, Μ.Βρεττανία και ΗΠΑ.

50. Proteomics • Συστηματική μελέτη του συνόλου των πρωτεϊνών που παράγονται από ένα γονιδίωμα • Ταυτοποίηση πρωτεϊνών και προσδιορισμός του ρόλου τους σε φυσιολογικές και σε παθοφυσιολογικές καταστάσεις