Detecção de ANA por imunofluorescência

1. Detecção de ANA por imunofluorescência Prof.Doutor José Cabeda

2. Doenças Autoimunes • Ehrlich – “horror autotoxicus” • Owens (1945) – Apesar da partilha sanguinea os gémeos bi-vitelinos não se rejeitam: tolerância imunológica ao gémeo • Billingham (1953) • transplantes em ratinhos adultos de estirpes diferentes são rejeitados • transplantes em ratinhos neonatais de estirpes diferentes são aceites mesmo depois de atingirem a vida adulta • Burnet (1956) Teoria da selecção clonal ou dos clones proibidos Prof. Doutor José Cabeda

3. Mecanismos de tolerância Imunológica • Eliminação clonal • Anergia Clonal • Supressão da resposta imunitária (células T supressoras) • Falha na apresentação antigénica • Baixa expressão de HLA-II • Tecidos imunológicamente privilegiados • SNC (barreira hemato-encefálica) • Testiculo (baixa temperatura) • câmara anterior do olho (elevada [TGFb]) • Rede idiotipo-antiidiotipo Prof. Doutor José Cabeda

4. Falha de eliminação clonal Linfócitos B1(CD5+) Alterações na apresentação antigénica Modificações dos autoantigénios Mimetismo molecular Expressão ectópica de HLA-II Rotura de anergia clonal IL-2 Expressão defeituosa de faz Activação policlonal LPS Superantigénios Rotura de anergia clonal Falha da regulação da resposta imunológica Falha das células supressoras mantém uma resposta em actividade Regulação antiidiotipica reacção cruzada com anticorpo anti bacteriano Anticorpos mimetizando ligandos celulares, induzem respostas via receptores celulares Equilibrio Th1/Th2 Regulação neuro-hormonal da resposta imunológica Mecanismos de Indução de auto-imunidade (I) Prof. Doutor José Cabeda

5. LES Lúpus discóide Esclerodermia Citopenias autoimunes Síndrome de Goodpasture Cirrose Biliar Primária Hepatite crónica activa Síndrome Guillain-Barré Uveite Fibrose Pulmonar Idiopát. Artrite reumatóide Artrite reumatóide juvenil Sindrome de Sjögren DMID (Diabetes ) Psoriase Doença de Graves Doença de Hashimoto Esclerose Múltipla Colite ulcerosa Doença de Chron Miastenia Gravis Patologias autoimunes sistémicas e de órgão Prof. Doutor José Cabeda

6. Rheumatoid Arthritis • An autoimmune disorder affecting connective tissue. • 3 million afflicted in US • Afflicts women during menopause • 48-52 years of age • shorten life expectancy by 3-7 years • Afflicts men = women after 65 years of age • shorten life expectancy by 7-10 years for men. • Etiology • Combination of factors including a genetic predisposition and triggered by unknown infectious agent (possibly EBV). Prof. Doutor José Cabeda

7. Clinical Manifestations • Joint problems over time • Occur symmetrically • Alteration in the wrist • Ulnar drift • Boutonniere deformity • Swan-neck deformity • Rheumatoid nodules Prof. Doutor José Cabeda

8. EXAMPLE OF ARTHRITIS OF THE LEFT KNEE Prof. Doutor José Cabeda

9. Systemic Lupus Erythmatosus • Chronic, inflammatory, autoimmune disorder • 2 types: discoid and systemic • Etiology - unclear • May be several risk factors - infection, exposure to UVB, environmental irritants Prof. Doutor José Cabeda

10. Systemic Lupus Erythmatosus • Pathophysiology • Produce autoantibodies due to defect in T-suppressor cells; NK cells are also suppressed • Autoantibodies - antinuclear antibodies (ANA) • when cell dies, nuclei bind with ANA, forms immune complex that stimulates inflammatory response • Immune complex also stimulates activation of complement Prof. Doutor José Cabeda

11. Discoid Lupus Prof. Doutor José Cabeda

12. Lupus Prof. Doutor José Cabeda

13. Prof. Doutor José Cabeda

14. Malar Rash (Butterfly Rash) Discoid Lesions: a thick, disk-like rash that scars, usually on sun-exposed areas Arthritis: inflammation of peripheral joints with tenderness, swelling or effusion with skin changes Prof. Doutor José Cabeda

15. Pericarditis Oral Ulcers Prof. Doutor José Cabeda

16. Provas directas Reprodução num recipiente normal por transferência de anticorpos Não aplicável ao Homem Provas indirectas Reprodução em animais por imunização com auto-antigénios Requer conhecimento do auto-antigénio Requer a administração de potentes adjuvantes Por transferência de Linfócitos para ratinhos SCID Identificação de auto-anticorpos ou células T auto-reactivas nos órgãos alvo Diagnóstico de D. Autoimune (I) Prof. Doutor José Cabeda

17. Diagnóstico de D. Autoimune (II) Provas circunstanciais • Associação com outras doenças auto-imunes • Infiltração linfocitica nos órgãos afectados • Associação com determinados haplotipos HLA • Detecção sérica de autoanticorpos • Resposta favorável a imuno-supressores Prof. Doutor José Cabeda

18. Prof. Doutor José Cabeda

19. Suggested Clinical and Laboratory Criteria For The Diagnosis of Antiphospholipid Syndrome Prof. Doutor José Cabeda

20. How is Lupus diagnosed? • When a doctor thinks a patient may have Lupus, an ANA blood test is ordered. • Other tests such as an anti-dsDNA, anti-Sm, anti-Ro/SS-A, and anti-RNP also may be ordered to determine if a patient has Lupus. • Complement tests are performed to measure the amount of complement proteins circulating in the blood. Prof. Doutor José Cabeda

21. Diagnostic Studies • ANAs are the best screening test • Antibodies to double-stranded DNA (dsDNA) and to Sm are relatively specific for SLE • Determining the complete autoantibody profile of each patient helps predict clinical subsets. High serum levels of ANAs and anti-dsDNA and low levels of complement usually reflect disease activity, especially in patients with nephritis Prof. Doutor José Cabeda

22. Algorithm for the diagnosis of SLE. ANA, antinuclear antibody; ACR, American College of Rheumatology; CTD, connective tissue disease; WBC, white blood cell count; RBC, red blood cell count, *, recommended in initial evaluation. Prof. Doutor José Cabeda

23. Diagnóstico de D. Autoimune (II) Provas circunstanciais • Associação com outras doenças auto-imunes • Infiltração linfocitica nos órgãos afectados • Associação com determinados haplotipos HLA • Detecção sérica de autoanticorpos • Resposta favorável a imuno-supressores Prof. Doutor José Cabeda

24. Doenças associadas a ANA Prof. Doutor José Cabeda

25. Auto-antigénios detectáveis com as células Hep-2 Prof. Doutor José Cabeda

26. Protocolo para detecção de ANA com células Hep-2 (II) • Soro colhido fresco ou a 4ºC (1-2 semanas) ou a –20ºC (periodos + longos) • Evitar ciclos congelar/descongelar • Congelação pode concentrar o soro (liofilização) • Testar diluições seriadas do soro em PBS (1:40, 1:80, 1:160,...) (semi-quantificação do título, melhores padrões, evitar falsos positivos ) Prof. Doutor José Cabeda

27. Protocolo para detecção de ANA com células Hep-2 (II) • Láminas com as células Hep-2 em monocamada (vários poços/lâmina). Deixar as lâminas chegar a RT antes de abrir o pacote selado. • Adicionar o soro diluído a testar, e incubar 30 min em incubadora húmida a RT • Lavar com PBS • Adicionar o secundário (cabra, ovelha ou coelho) marcado com FITC, e incubar como acima • Universal (anti IgH de IgG,IgM,IgA não purificado) • Anti-IgG (as mais importantes p/ diagnóstico) • Anti-IgM (SLE pediátrico) • Lavar com PBS • Contrastar com 1 a 2 gotas de Azul de Evan’s a 1% por 100 mL PBS • Lavar com PBS • Montar em glicerol Prof. Doutor José Cabeda

28. Padrões Hep-2 (I) Prof. Doutor José Cabeda

29. Padrões Hep-2 (II) Prof. Doutor José Cabeda

30. Padrões Hep-2 Prof. Doutor José Cabeda

31. Padrões gerais ANA (Nucleares) Prof. Doutor José Cabeda

32. Tipos de padrões Hep-2 Prof. Doutor José Cabeda

33. Resolução de Problemas Prof. Doutor José Cabeda