Получение гаплоидов и манипуляции с плоидностью для повышения эффективности селекции растений

1. Получение гаплоидов и манипуляции с плоидностью для повышения эффективности селекции растений

2. Гаплоидами у покрытосеменных растений называют особи, имеющие гаметический набор хромосом по отношению к уровню плоидности родительской особи. Удвоение хромосом у гаплоидов диплоидных видов (получение удвоенных гаплоидов) позволяет получать гомозиготные линии, которые представляют значительный интерес для селекции. Гаплоиды могут возникать естественным путем в результате нарушения процесса оплодотворения из неоплодотворенных яйцеклеток или других клеток зародышевого мешка, при элиминации хромосом одного из родителей в зиготе или замещении ядра яйцеклетки ядром спермия. Первым растением, которое было идентифицировано в качестве гаплоида, был дурман Daturastramonium (Solanacea), выявленное A.F. Blakeslee в 1921 году. Позже гаплоиды были обнаружены и у многих других растений, однако частота их появления в природе оказалось крайне незначительной (0,001 – 0,01%) и не могла удовлетворить потребности генетики и селекции.

3. Для редукции числа хромосом у растений применяют два основных подхода: – андрогенез (от греч. andros – мужчина и… генез) в культуре in vitro пыльников или микроспор, – гиногенез (от греч. gyne – женщина и… генез) из неоплодотворенных яйцеклеток или других гаплоидных клеток зародышевого мешка в культуре in vitro, а также из имеющих гаплоидный зародыш семян, полученных при опылении материнского растения пыльцой другого вида или специального гаплоиндуктора.

4. Культура invitro пыльников и микроспор Высшие растения имеют жизненный цикл, в котором чередуются фазы гаплоидного гаметофита и диплоидного спорофита. Во время фазы гаметофита материнские клетки пыльцы, находящиеся в пыльнике, претерпевают мейотическое и митотическое деления, результатом которых является образование мужского гаметофита – пыльцевых зерен. Под воздействием определенных воздействий в условиях культуры пыльников in vitro некоторые микроспоры способны менять программу развития с гаметофитной на спорофитную и давать, в результате, начало эмбриоидам или образовывать каллюс. Из эмбриоидов или каллюса можно получить растения-регенеранты, которые являются гаплоидами или удвоенными гаплоидами. Это явление получило название андрогенеза или пыльцевого эмбриогенеза (pollen embryogenesis, microspore embryogenesis)

5. Культура invitro пыльников и микроспор Возможность получения гаплоидов путем культивирования in vitro пыльников растений впервые была продемонстрирована в 1964 г сотрудниками Отдела ботаники Университета г. Дели (Индия) S. Guha и S.C. Maheswari В 1973 году французские ученые С. Nitsch и В. Norreel впервые получили гаплоидные эмбриоиды путем культивирования in vitro микроспор Daturainnoxia, изолированных из пыльников.

6. Культура пыльников

7. Культура invitro пыльников и микроспор Культура микроспор пшеницы (по Zheng, 2003): Колоски, погруженные в питательную среду, измельчают с помощью блендера. Полученный гомогенат фильтруют последовательно через сетчатые фильтры с размером ячеек 100 μм и 38 μм, чтобы отделить микроспоры от грубых остатков тканей и клеток. Микроспоры, собранные на фильтре с размерами ячеек 38 μм, смывают раствором 0,3 М маннитола, наслаивают на 0,58 М раствор мальтозы и центрифугируют при небольшой скорости (100-150g). Жизнеспособные эмбриогенные микроспоры располагаются на границе этих двух растворов, в то время как другие клетки и примеси оказываются в осадке. Фракцию микроспор несложно собрать с помощью автоматической пипетки и перенести в жидкую питательную среду для культивирования.

8. Культура микроспор

9. Формирование пыльцевых зерен (гаметофитный путь развития) у высших растений

10. Изменение программы развития с гаметофитной на спорофитную Изменение программы развития с гаметофитной на спорофитную в культуре in vitro происходит только в том случае, когда - микроспоры находятся на определенной стадии развития - являются чувствительными (компетентными) к различным внешним воздействиям, способным вызвать такое изменение программы. Имеется достаточно много экспериментальных данных, указывающих на связь между андрогенетической способностью генотипа и формированием микроспор определенного типа (эмбриогенных). Было показано, что число эмбриогенных микроспор детерминировано для конкретных растений-доноров пыльников и не увеличивается в ходе культивирования пыльников, а условия культивирования лишь способствуют или препятствуют реализации их развития. Теория, которая считает приоритетной роль эмбриогенных микроспор в процессах андрогенеза в культуре пыльников и микроспор, получила название теории детерминации [Heberle-Bors 1985]

11. Эмбриогенные микроспоры Эмбриогенные микроспоры имеют существенные ультраструктурные и функциональные отличия от нормальных микроспор. Для них характерно смещение вакуоли от центра к экзине на вакуолярной стадии развития микроспор и последующая реадсорбция вакуоли на двухядерной стадии с сохранением ее видимых фрагментов возле экзины; в результате формируется специфическая, так называемая «звездчатая структура», состоящая из цитоплазматических тяжей, соединяющих перинуклеарную и субкортикальную области цитоплазмы. Отмечается менее плотная цитоплазма, отсутствие накопления крахмальных зерен, характерное для нормальных созревающих генеративных клеток, происходит изменение клеточного цикла. Было обнаружено образование в эмбриогенных микроспорах в ходе культивирования in vitro специфической мРНК, не присутствующей в нормальных микроспорах, что говорит о транскрипции у них особых генов, связанных с развитием по спорофитному пути.

12. Эмбриогенные микроспоры

13. Пыльцевой диморфизм

14. Пути формирования эмбриоидов или каллюса из эмбриогенных микроспор А-путь. Микроспора подвергается первому неравному митотическому делению. В дальнейшем происходят симметричные деления только вегетативной клетки, в результате чего образуются гаплоидные эмбриоиды. Генеративная клетка не делится и погибает. Е-путь. Микроспора подвергается первому неравному митотическому делению, в дальнейшем происходят симметричные деления генеративной клетки. В результате образуются гаплоидные эмбриоиды или каллюс. В-путь. Первое митотическое деление, в отличие от нормального, является симметричным, что приводит к формированию двух одинаковых вегетативных клеток. Их последующее митотическое деление ведет к образованию многоклеточных структур. Развитие по В-пути обычно приводит к формированию гаплоидных или диплоидных эмбриоидов (удвоенных гаплоидов) С-путь. Микроспора претерпевает нормальное митотическое деление, в результате которого формируются вегетативное и генеративное ядра. Затем ядра сливаются, последующие митотические деления приводят к образованию многоклеточных структур, которые в дальнейшем развиваются посредством эмбриоидогенеза или каллюсогенеза, давая начало преимущественно удвоенным гаплоидам.

15. Факторы, оказывающие влияние на эффективность андрогенеза в культуре пыльников и микроспор: - Генотип - Физиологическое состояние и условия культивирования растений-доноров пыльников или микроспор - Оптимальная фаза развития микроспор - Экспериментальные воздействия на растения-доноры пыльников или эксплантаты до начала культивирования (обработка ФАВ, стрессовые воздействия) - Состав и консистенция питательной среды, условия культивирования эксплантатов

16. Определение плоидности растений-регенерантов

17. Проблема альбинизма растений-регенерантов

18. Получение гаплоидов с помощью культуры неоплодотворенных семяпочек и завязей

19. Получение гаплоидов с помощью культуры неоплодотворенных семяпочек и завязей В качестве эксплантатов для культивирования in vitro обычно используют молодые неоплодотворенные семяпочки или завязи. Так, для сахарной свеклы оптимальный вариант предполагает использование в качестве эксплантатов семяпочек из закрытых бутонов со средней части соцветия, которые содержат недифференцированные 8-ядерные зародышевые мешки. После помещения на питательную среду развитие женского гаметофита, в отличие от мужского, продолжается и в результате образуется зрелый зародышевый мешок. По спорофитному пути, как правило, развивается, при определенных условиях культивирования, яйцеклетка.

20. Получение гаплоидов с помощью гаплопродюсеров Развитие гаплоидов из женских половых клеток можно индуцировать in situ (лат.: на месте) путем: опыления пыльцой другого вида, того же вида, облученной пыльцой. Возможны два основных механизма возникновения гаплоидов в результате таких опылений: - после оплодотворения яйцеклетки образуется гибридный зародыш, в котором на ранних стадиях эмбриогенеза происходит элиминация хромосом одного из родителей (чаще всего опылителя); - оплодотворение яйцеклетки не происходит, но стимулируется к дифференцировке

21. Гаплопродюсеры: Материнские растения культурного ячменя Hordeumvulgare(2n=2x=14) опыляют пыльцой дикого ячменя H. bulbosum(2n=2x=14). Используют эмбриокультуру Для получения гаплоидов пшеницы ее опыляют пыльцой кукурузы, сорго, теосинте, декоративного проса Pennisetumglaucum, дикого ячменя H. bulbosum Дигаплоиды (2n = 2x = 24) культурного картофеляS.tuberosum L. получают путем опыления растений картофеля (2n = 4x = 48) пыльцой S. phureja(2n = 2x = 24) (гаплопродюсеры с маркерным признаком «эмбриональное пятно» IvP35, IvP48, IvP101) Американский селекционер Е.Н. Coe в 1959 г. выделил инбредную линию кукурузы Stok 6, которая в скрещиваниях с другими линиями кукурузы в качестве опылителя была способна давать в потомстве до 2,3% гаплоидных растений. Созданы линии-гаплопродюсеры кукурузы, которые используют в качестве материнских форм с целью получения гаплоидов от растений, пыльцой которых их опыляют [Kermicle 1969]

22. Гаметоклональная изменчивость Гаметоклональная изменчивость - изменчивость растений, полученных с помощью различных методов из генеративных клеток (гамет). Основным источником гаметоклональной изменчивости является генетическое разнообразие гамет, которое возникает в процессе рекомбинации генов во время мейоза. Эта изменчивость максимальная в случае получения гаплоидов или удвоенных гаплоидоввысокогетерозиготных гибридов В случае, когда получают удвоенные гаплоиды относительно гомозиготных форм растений, основную роль играет изменчивость, вызванная культивированием клеток, и изменчивость, возникающая при удвоении хромосом у гаплоидов. При получении удвоенных гаплоидов гибридов селекционную ценность представляет, в основном, изменчивость, обусловленная рекомбинацией генов в процессе мейоза при образовании гамет.

23. Гаметоклональная изменчивость В Институте генетики и цитологии НАН Беларуси впервые было предложено использовать гаметоклональную вариацию, связанную с формированием нередуцированных гамет, для улучшения сортов картофеля – высоко гетерозиготной полиплоидной культуры, размножаемой вегетативно [Воронкова, Ермишин, 2003]

24. Использование гаплоидов в селекции растений Ускорение получения гомозиготных линий самоопылителей (сорт пшеницы EtsDesprez во Франции был отобран среди всего 64 удвоенных гаплоидов, полученных от гибридов F1 [de Buyser et al., 1987]. Тем не менее, некоторые селекционеры рекомендуют использовать для получения удвоенных гаплоидов не гибриды F1, а F2 или F3). Сокращение сроков создания родительских гомозиготных линий перекрестноопыляемых культур и родительских линий для получения гетерозисных гибридов. Возможность получения гомозиготных линий у самонесовместимых видов. Удвоенные гаплоиды нашли применение и для повышения эффективности рекуррентного отбора.

25. Манипуляции с плоидностью исходного материала для повышения эффективности селекции полиплоидов (на примере картофеля) Получение дигаплоидов сортов картофеля; Гибридизация дигаплоидов с дикими диплоидными видами; Селекция на диплоидном уровне: комбинация и концентрация желаемых генов и элиминация нежелательных; Мейотическое удвоение хромосом у отобранных генотипов (гибридизация сортов картофеля с дигаплоидами, формирующими нередуцированные гаметы) [Chase 1963; Peloquin et al. 1989].

26. Эффективность использования в селекции картофеля мультиплексных родительских линий и дигаплоидов Симплекс × нуллиплекс H1hhh × hhhh = 1 устойчивые : 1 восприимчивые Дуплекс × нуллиплекс H1H1hh × hhhh = 5 устойчивые : 1 восприимчивые Триплекс ×нуллиплекс H1H1H1h × hhhh=все устойчивые 4х Нуллиплекс × 2х гетерозигота (2n-гаметы) hhhh × H1h (2n-гаметы) = все устойчивые

27. Преимущества «диплоидной» селекции по сравнению с традиционной Благодаря более простому дисомному наследованию требуется меньший объем популяции для выделения сложных рекомбинантов, отвечающих запросам селекции Возможность широкого использования генетического разнообразия диких диплоидных видов, интрогрессии селекционно-ценных генов диких видов в селекционный материал, расширения аллельного разнообразия S. tuberosum Благодаря мейотическому удвоению хромосом возможность получать более выровненные, продуктивные, экологически стабильные тетраплоидные гибридные популяции, не расщепляющиеся по комплексу признаков, отселектированных на диплоидном уровне