췌장의 조직학적 구조

2. 췌장의 조직학적 구조 EXOCRINE 1) Carbohydrate – amylase 2) Lipid - lipase, phospholipase A2, carboxyl esterase 3) Protein  - trypsin, chymotrypsin, elastase ENDOCRINE (1) A(alpha or glucagon)세포 (2) B(beta or insulin)세포 (3) D(delta or somatostatin)세포 (4) PP(pancreatic polypeptide)세포 (5) G 세포 (gastrin)

3. Amylase의 분류 1) α-Amylase ⑴ Starch(전분) → Maltose, Glucose로 가수분해 ⑵ 동물 , 식물 , 미생물 등에 널리 존재한다 ⑶ 사람에게는 α-Amylase만 존재 한다. 2) β-Amylase ⑴ Starch (전분) → Maltose 단위로 가수분해 ⑵ 식물에 존재 3) γ-Amylase (1) Starch (전분) → Glucose 단위로 가수분해 Amylose, Amylopectin, Glycogen 등의 다 당류을 분해하여 환원당인 Dextrin→maltose, → isomaltose, glucose 로

4. Amylase의 특성 1)기질 ⑴ 타액 Amylase: 감자 전분에 친화성이 높다 ⑵ 췌장 Amylase: 옥수수 전분에 친화성이 높다 ⑶ 올리고당을 기질로 사용하면 친화성의 차이는 거의 없다 2)활성제 ⑴ Cl-, Br-, Ca+2, I2-, ... ... ... 등 음이온이 많다 ⑵ Cl- 과량 사용할 때 저해제로 작용 (0.01M = 10mM 정도 ) 3)저해제 ⑴ EDTA , Citrate , Oxalate , NaF 등의 항응고제 ⑵ Ca+2을 제거에 의한 활성을 저해한다. ⑶ Urea , Albumin, Lipemic Serum 4) Amylase 분비 촉진 Hormone : Pancreozymin

5. Amylase 작용기전 α-amylase : α-1.4 - linkage 무 선택적 hydrolysis β-amylase : α-1. 4 - linkage 비 환원성 말단, maltose단위로 분해 α-glycosidase : α-1.4-linkage비 환원성말단, glucose단위로 분해 Isoamylase : α-1.6-linkage만 가수분해 Cellulase : 1.4-β-glycoside linkage가수분해

6. 검사법의 배경 19세기 초 → 존재인색(소화 효소일종) • 1831년 → Leuchs : 전분분해 효소(수액중) • 1845년 → Bouchardat : 전분 분해 효소(췌장액중) • 1895년 → Beyerrinck : Amylase (전분분해효소) • 1908년 → Wohlgmuth: Iodometric method(B,U) 1925년 Kuhn은 α-amylase와 β-amylase존재를 기술 • 1916년 → Stocks : 임상적의의 부여 • 1929년 → Elman : Acute pancreatitis(early stage) • 1934년 → Katsch : 효소이탈

7. Amyloclastic method (Iodometric) 남아있는 전분을 Iodometric측정하는 것-  albumin 과 고지혈 저해 인자로 작용. Wohlgemuth M, Van-Loon M, Caraway M, • Saccharogenic method 분해에 의하여 형성된 환원당을 측정- 당량, 감도, 복잡 Somogyi M, Meyer M, Henry M, Sax M, Anthron M, dinitrosalicylic M • Chromogenic method 색소를 전분에 결합시킨 것을 기질로 하고  유리된 색소를 정량. 재현성이 양호, Blue starch법, Dyamyl 법, Amylochrome법 • Oligoglucose method 가수분해한 생성물에 효소를 공역 반응시켜 산화 효소계, 탈 수소효소계 이용 • 합 성 기 질 법 4-nitrophenyl, G7-4-NP, G5-4NP 등 합성발색기질을 이용 측정, 4-NP를 표시한 기질에 α - amylase와 α-glucosidase작용하여유리된  PNP를 비색측정

8. Amyloclastic method (Iodometric) Caraway method 10mg / 100ml /37℃ / 30min  Winslow method     Wohlgemuth

9. Saccharogenic method Somogyi-Nelson 1mg/100ml/37.5’C/30min

10. Chromogenic method Blue starch method Cibachron blue F3GA blue starch polymer 유리되는 가용화 색소기질 분해물을 비색 정량 DyAmyl-L Method Amylopectin 결합물을 기질 Reactone red 2 B ZnCl2 -ethylene glycol monomethyl ethter 상청 중의 색소 결합성의 기질 분해물을 비색

11. Oligoglucose method

12. 합 성 기 질 법 P-nitrophenyl maltohepatoside( p-NP-G7) Maltopentaose oxidase

13. 측정 원리 및 시약 CARAWAY- METHOD 전분을 함유한 기질 완충액에 혈청 (뇨 )을 반응시키 검체 중 amylase에 의해 전분이 가수분해. 일정 기간 후에분해되고 남은 전분을 요오도로 발색시켜(청녹색) 측정한다. Amylase Starch Substrate(pH 6.8-7.2) Na2HPO4       26.6g Benzoic Acid     8.6g . Starch 0.4gm. 증류수 500ml 1/10N Stock Iodine solution  Pot, iodine(KIO3) -1.785g,     Pot, iodide(KI) - 22.5g H2SO4 - 4.5 ml 증류수 - 500ml  1/100N Working Iodine solution  Stock iodine sol(1/10N) 50ml를 증류수 500ml으로 희석

14. PROCEDURE

15. Normal Value : 60 ∼ 180 Somorgy unit/100 ㎖ 70 ∼ 2500 somorgy Unit /1hr urine 1200 - 5000 Somogyi Unit / 24hr urine     50 ∼ 170 Caraway Unit/100 ㎖          • Somogy 단위 : 혈청 100㎖으로 부터 37 ℃, 30분 간 유리 • 된 환원당의 ㎎수에 상당하다 • 국제단위(IU)  : Somogy을 국제 단위로 환산

16. 임상적 의의 1)타액 Amylase (S형 Amylase) 2)췌장 Amylase (P형 Amylase)

17. 간섭인자 Citrate, Oxalate, EDTA, NaF,- 부의 오차(Ca억제) Bilirubin, hemoglobin 측정치에 영향. Triglyceride가 500mg/dl 혼탁에 의하여 활성 억제. ↑음주과다, Aminosalicylic  acid, Asparaginase, Azathioprine, Corticosteroid, Cycloheptadine, Nacortic analgesis,  Rifampin, 피임약, 이뇨제. Sulfasalazine, flouride 활성 저하. 급성췌장염 발증 후 4-12시간에 최고 치, 48-72시간 후엔 정상치로 회복.

18. Iso-Electrophoresis

21. LIPASE

22. Lipase Substrate 1,2-O-dilauryl-rac-glycerol-3-glutaric acid(6-methylresorufin) ester

23. 중화적정 법  Cherry-Crandall  Tietz method 혈청 1㎖중에 함유된 효소가 작용하여 생성 되는 Fatty acid를 중화하는데 소비된 0.05N NaOH의 ㎖수

24. 1) olive oil emulasion    2) Stock tris buffer sol   3) 0.05N Sod, hydroxide.- 1N NaOH 20X 4) 1% Thymolphthalein ( indicator)  Tietz method 증류수              75 ml           Sod benzoate      0.15gm          Arabia Gum         5.25gm      Olive Oil           75 ml    tris(hydroxylmethyl)aminomethan.....48.55gm   Distil Water    .................................500ml Stock sol..............................50ml 1N HCL...............................21.5ml  (Ajust pH 8.0)   Distill water.........................200ml

25. 잘 혼합후, Blank 검체를 먼저 0.05N NaoH로 적정(Blue) 한   Unknown검체도 동일 방법으로 적정하여 NaOH의 소비량을 기록한다.

26. Lipase -Enzymatic method - 1 R1 BICIN buffer : 50mmol/L, pH 8.0; (250㎕). (2.0㎕) Colipase(porcine pancreas): ≥0.9mg/L; Na-deoxucholate: 1.6mmol/L; calcium chloride: 10mmol/L; detergent; preservative R2 Tartrate buffer : 10mmol/L, pH 4.0; (200㎕) 1,2-O-dilauryl-rac-glycerol-3-glutaric acid(6-methylre sorufin) ester : 0.27 mmol/L; Taurodeoxycholate: 8.8mmol/L; detergant; preservative

27. LIPASE - Enzymatic method - 2 Vogel-Zieve Shihabi-Bishop The decrease in turbidity is measured at 340nm 1) Buffer - Tris buffer 26mmol/L, pH 8.9 2) Substrate sod deoxycholate 16.7mmol/L calcium chloride 0.04mmol/L Triolein0.3mmol/L colipase 4mg/L 3) Standard - lipase activity stated on vial in U/L/37’C

28. Procedure Mix Avoid the formation of foam. Read absorbance A1 of standard, control and sample after 4min. After a further 5min read absorbance A2 of standard, control and sample. 340nm △A of standard, control and sample. = A1 – A2

29. LIPASE - Enzymatic method - 3 천연기질인 1.2-Diglyceride를 사용하여 lipase에 의해 생성되는 2-Monoglyceride를 Quinone color 측정

30. Reagent-1 1.2-Diglyceride, Monoglyceride lipase(MGLP) Glycerol kinase(GK) Glycerol-3-phosphate oxidase(GPO) Adenosine-3-phosphate(ATP) N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfoprophyl-m-toludine(TOOS) Reagent-2 4-Aminoantiphyrine Peroxidase

31. PROCEDUER • 검체 5㎕에 효소 기질액 300㎕ 분주, 잘 혼합 후 37℃에서 5min 간 incubation 2) 5분 후 발색액 100㎕를 가하여 혼합 후, 3-5분 사이에 주파장 546㎚ 에서 흡광도 변화를 측정 한다

32. 특 징 ◀기질인 1.2-diglycerid을  가용화한 것을 사용하므로 측정 범위 가 넓다 ◀Colipase 및  Deoxycholine 의 활성제를 사용하므로 췌장 lipase 에 특이성이 높으며 Esterase  Liver lipase, lipoprotein lipase 의 영향이 없다   ◀Free glyceride, ascorbic acid 의 영향이 전처리 과정에서 소거 되므로 영향이  없다