细胞形态学检查

1. 细胞形态学检查 • 一、倒置显微镜观察细胞的形态 • （一）一般的形态学观察： • （二）用相差显微镜观察细胞的形态 • （三）荧光显微镜观察细胞的形态和结构

3. Identification of cultured adult rat RGCs. Cultured cells were co-labeled with anti-Thy-1 antibody (A), anti-NF-L antibody (B), and DAPI (C). (D) A digitally merged image simultaneously represents all three fluorescent labels. (E) The corresponding phase-contrast image.

4. 免疫荧光染色法 • 用于标记二抗体的荧光素： • （1）异硫氰酸荧光素（FITC） • 发射的荧光波长为490～619（绿色荧光） • （2）四乙基罗丹明：荧光波长为540～660（橙红色荧光） • （3）DAPI或Hoechst33258 : 染核，用紫外激发

5. 免疫荧光的染色步骤 • 1、用95%乙醇固定细胞10-30 分或用冷丙酮固定5～10分。 • 2、用PBS洗3次。 • 3、用PBS配制的1‰Triton 10分。用PBS洗3次 • 4、用2%～5%BSA封闭2 小时 • 5、加入一抗过夜，PBS洗3次 • 6、加入二抗1～2小时， PBS洗3次 • 7、核复染，荧光显微镜观察。

6. 正常细胞和组织的培养 • 一、上皮细胞培养(epithelial culture)上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。

7. 体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。

8. 表皮细胞培养 • 1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.5－1平方厘米小块。2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分钟。6、反复吹打，制成悬液。7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。

10. Cultured Mouse Mammary Epithelial Cells

11. 神经胶质细胞培养 • 神经细胞（神经元〕不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，

12. 获取脑组织后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一、二次。2、置于30—50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。3、把悬液注入离心管室温中直立5—10分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网过滤，计数并调整细胞密度。 5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。细胞传代可以0.25%胰酶消化处理。

13. Cultured neuron

14. Cultured microglia

15. 大鼠肝细胞的培养(成年) • 培养液: Koga 培养液, 最好加入Williams 和Waymouth MB752/1) • 消化液:型胶原酶300U/mg, 使用浓度为0.025% • 方法: 1 灌流法分离肝细胞：门静脉和下腔插管静脉插管 • 2、用预灌流液(8.3 mg/ml NaCl,0.5 mg/ml KCl,2.4 mg/ml HEPES,pH 7.4)灌流8分钟

16. 3、用含0.05%胶原酶的灌流液(预灌流液中加入5 mmol/LCaCl2, 0.05%胶原酶)继续灌流10分钟。 • 4、将肝叶剪下,将消化好的肝细胞轻轻刮下,获得的肝细胞悬液离心(600 r/min)三次,每次2分钟 • 5、然后重新悬浮于WE培养基中(含10%血清, Insulin 0.2 U/ml, L-Glutamine 0.292 mg/ml，100 nM dexamethasone )。 • 6、Isolated cells were plated on collagen type I-coated dishes in medium I consisting of Williams‘ medium E 。

17. Hepatocyte Isolation and Culture • Hepatocytes were isolated from the liver of fed male BALB/c mice (22-25 g) by using the two-step collagenase perfusion method. After the induction of anesthesia with pentobarbital sodium (400 mg/kg ip), the peritoneal cavity was opened, and the liver was perfused in situ via the portal vein for 4 min at 37°C with calcium-free HEPES buffer and for 7 min with HEPES buffer containing 45 mg/100 ml collagenase D (Boehringer-Mannheim, Laval, QC, Canada) and 135 mg/100 ml CaCl2. The perfusion rate was set at 5 ml/min for both solutions.

18. The cells were used only if cell viability, as determined by trypan blue exclusion, was >80%. The cells were seeded onto plastic petri dishes (26,000 cells/cm2) in Williams' medium E (GIBCO BRL, Toronto, ON, Canada) supplemented with 10% fetal bovine serum (GIBCO BRL) and allowed 90 min to attach. The serum-containing medium was then removed, and the cells were subjected to different culture conditions in serum-free medium.

19. Fig. 5. Morphology of EGF-treated mouse hepatocytes in the presence and absence of PD-168393. Primary mouse hepatocyte cultures were incubated with medium (untreated) or EGF (50ng/ml) in the presence or absence of 10 µM PD-168393. After 24h in culture, EGF-treated hepatocytes were spread, and their cell surface increased compared with untreated cells. Hepatocytes treated with EGF in the presence of PD-168393 were spheroid and resembled control cells with or without PD-168393. Magnification, ×100.

20. 大鼠心肌细胞的培养 • 新生大鼠鼠龄的选择 • 新生大鼠心肌细胞在出生后3d内具有部分的增殖能力,成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞,不再具有分裂增殖能力.因此,大鼠出生时间越短,其心肌细胞分离后成活率越高,越容易贴壁生长.大量观测表明,选择13 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.

21. 神经细胞分散培养 • （一） 选材 常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以19d为宜，小鼠以18d为宜，大鼠纹状体以10d为宜；若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚，则黑质以13d，纹状体18-21d为宜；小脑以20-21d小鼠胚胎，所获蒲氏细胞成活率高，颗粒细胞正在分化；脊髓与DRG联合培养，常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神经成活率高。

22. (二） 取材。脑则取出相应组织，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓则固定于琼脂板上，用小刀将其要成背腹两侧，分别培养。 • （三） 细胞分离与接种。神经组织用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接种液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用细口吸管吹打细胞悬液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上层细胞悬液，计数，预置细胞密度，接种于培养皿（1×106），做电生理应为5×105或更低。

23. （四） 抑制胶质细胞生长。培养3-5d后，也有人认为培养7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神经胶质细胞的生长。（五） 观察。接种6-12h，开始贴壁，并有集合现象，细胞生长突起明显，5-7d胶质细胞增生明显，7-10d胶质细胞成片于神经细胞下面，形成地毯，2周时神经细胞生长最丰满，四周晕光明显，一个月后，有些神经细胞开始退化，变形，甚至出现空泡，一般培养2-4周最宜。

24. 但神经细胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能传代，不会有细胞周期，而且随培养时间的延长，细胞数量在下降，但胶质细胞可以，神经胶质细胞也可以。在培养过程中，早期9-12d时，有较多的神经细胞死亡，这是第一次死亡阶段，应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多，且相互形成突触。但神经细胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能传代，不会有细胞周期，而且随培养时间的延长，细胞数量在下降，但胶质细胞可以，神经胶质细胞也可以。在培养过程中，早期9-12d时，有较多的神经细胞死亡，这是第一次死亡阶段，应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多，且相互形成突触。

25. Neuronal culture • 1. Rat pups aged l-l 5 d, were killed by cervical dislocation. • 2. Cortex placed in Earle’s balanced salt solution (BSS) at 37°C. and cut into 500 urn slices • 3. Slices of visual cortex were incubated at 37°C with gentle stirring in 10 ml of enzyme solution • 4. After 1.5 hr. the slices were rinsed briefly with Earle’s BSS containing BSA, 1 mg/ml. • 5. The slices were gently triturated with a fire-polished Pasteur pipet in 2- 3 ml of this solution.

26. Freshly dissociated cells that excluded the dve Erythrosin B (Phillips, 1973) were considered to be viable. Dissociated cells were harvested by low-speed centrifugation (10 min, 70 x g) through 5 ml of Earle’s BSS containing BSA (10 mg/ml) . Cells were resuspended in growth medium and plated in modified petri dishes. Typically, cells from a single rat pup were used to prepare 40-50 culture dishes. Optimal viability and morphological preservation of the dissociated cells were obtained using the enzyme papain.

27. 血管内皮细胞的培养 • 取材 人和动脉不同部位、不同血管如大动脉与小动脉、毛细血管，以及静脉血管之间存在差异，在处理这些细胞时应分别对待。 血管内皮细胞形态较小，近似圆形，呈均匀排列，一般取材于人和动物的脐带。

28. 人大动脉内皮细胞培养 • 人大动脉内皮细胞可来自手术、病理活检组织，也可来自尸体（需在死后24h内取材) • 方法: (1)小心剥除已游离的大血管外膜，置于盛有冷的磷酸盐平衡盐溶液平皿中反复漂洗，洗净血管内、外面的血液和脂质。 • （2）剪开血管，放入37℃消化液中，60 min，消化结合后，用23号针头注射器吸取消化液冲洗血管内腔， • （3）收集消化液置无菌试管中，离心（1000rpm 7min）弃上清，加入含血清培养基中，使细胞重新悬并调整细胞数。 • （4）接种于相应大小培养瓶或培养皿中，37℃恒温温箱培养，一周后内皮细胞可长成单层，呈多角形铺成石状排列。

29. 注意事项 • ：①如果小于23号针头则回收内皮细胞效果差，若针头过大则注射器内压大会吸入紧贴内皮细胞的平滑肌细胞，因此注意使用恰当的针头；②人血管内皮细胞对营养条件要求高，是依赖于生长因子的一种细胞。常用的培养基为RPMI 1640，培养时添加15% FBS，15%Nu-Serum，5～20μg/ml的内皮细胞生长因子（ECGF）以及100μg/ml的肝素。改进的培养基有MCDB109培养基，市场上也有内皮细胞商品培养基，可根据需要选择购买；③培养基中必须加入相应抗生素，最终浓度：庆大霉素为15μg/ml，氨苄青霉素为50μg/ml，二性霉素B1～2μg/ml，二甲胺四环素1μg/ml。在48h内可以防止细胞感染，3日后还应添加庆大毒素。

30. 脐带静脉内皮细胞培养 • 在婴儿出生时立即将脐带放置于无菌的500ml磷酸盐溶液（PBS）中低温保存。次日分离细胞。脐带有一根静脉两根动脉，通常用内腔大静脉。将洗净的静脉一端用夹子夹紧，一端注入消化液，静置孵育片刻。然后PBS或培养液反复抽吸内腔，收集后与消化液一并离心、沉淀内皮细胞。所用培养基与大动脉内皮细胞培养基相同，脐带静脉内皮细胞、大动脉内皮细胞易于培养，既使不加生长因子在最初几代细胞也会增殖良好。

31. 血管内皮细胞重要标志 • （1）第Ⅷ因子关连抗原（von willebrand factor,VWF），可以由全身所有血管内皮细胞产生，检测这一因子主要用相应抗体。VWF有其特异性，人的VWF抗体对牛的内皮细胞没有交叉反应。兔疫荧光间接法测定该因子，阳性细胞出现细长的荧光颗粒，在核周围的颗粒较密，细胞边缘颗粒较少。 • （2）Weibel-Palade小体，该小体是血管内皮细胞又一特异性的标志。电子显微镜下，呈现0.1～0.3μm,长0.5～5μm的椭圆形棒状结构。上述的VWF就是该小体产生的。

33. 血管平滑肌细胞的培养 • 血管平滑肌细胞培养常用的方法有贴块法（explant）和酶解离法（enzyme disperse）。贴块法具有获得平滑肌细胞纯度高，量多，操作简便的优点。但用贴块法易使平滑肌细胞胞质内肌丝丧失，亚细胞器增加。相反，酶解离法，由于酶的作用使细胞间失去连接，细胞内肌丝含量丰富，保持收缩型状态。培养平滑肌细胞常取材于兔、猪、鼠、猴的胸腹主动脉段。

34. 1．贴块法 • 方法：动物经颈动脉放血后，在无菌操作下迅速取出胸腹主动脉段，置于含Hank's液的平皿中漂洗3次，将凝块洗干净后剥除外膜的纤维脂肪层，然后纵行切开血管，刮除内膜即内皮细胞迅速撕下中膜内、中层，切成约1mm宽的小条，浸泡在含血清的Hank's液中，并将撕下小组织块种植于培养瓶壁。置于37℃恒温箱，2h左右，取出培养瓶加入20%胎牛血清的培养液，再放回培养箱内静止培养4天。4天后可见细胞从组织中迁移游出。

35. 培养时注意事项 • 为了保证培养的成功，应注意：①种植组织块的数目，如75cm2的长颈瓶组织块不得少于30个；②根据培养细胞的种属加入适量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，应加胎牛血清（FBS），通常浓度为10%～20%；③培养基的选择：常用的有DMEM（Dulbecco's modified Eagles'medium），M199培养基。培养兔的平滑肌细胞用DMEM效果较好。

36. 2．酶解离法 • 沿动脉纵轴切开后，刮除内皮细胞撕下中膜的内2/3，注意不要混入内皮细胞，将组织块切成1-2 mm2，放入加有3mg/ml胶原酶的无血清M199培养基中，37℃，0.5～1.5h。离心去上清，重复上述消化步骤，然后再离心（9000r,4min），收集细胞，在5%～10%同种血清或胎牛血清的M199培养基中调整细胞数，然后转入30～90mm培养皿中培养，对于兔子应加入高浓度的谷氨酰胺（0.2g/L）较佳。不同研究者在培养基、酶浓度以及消化时间等的选择都有很大的差异。

37. 动脉平滑肌的特性 • 由于贴块法和解离法处理方式不同，在细胞培养的最初阶段细胞形态和性质存在差异。随着培养时间的延长，培养环境趋于一致，细胞特性上也趋于近似。 • 光学倒置显微镜下观察：原代平滑肌细胞形状多样，一般常为梭形、带形、三角形或星形。贴块法培养，细胞可于2周后长成单层；而酶解离只需6～7天，镜下可见明显“峰-谷”样生长。

38. 牙髓细胞的培养 • 培养用液： • PBSA； • 胶原酶：I型，用D－Hank’s液配制，625U/ml； • 培养液：DMEM＋10％FBS； • Protocol： • 取拔除的正畸牙或阻生牙（年龄小者较佳），尽量完整的取出牙髓，置于培养皿中，用PBS冲洗； • 将牙髓放入离心管，加入胶原酶2－3ml/牙，37℃，2－3小时（原则是将牙髓消化彻底）； • 加入等量培养液，吹打至单细胞，离心，重悬，接种，牙/6well；

39. 牙周细胞的培养 • 培养用液： • PBSA； • 胶原酶：I型，用D－Hank’s液配制，625U/ml； • 培养液：DMEM＋10％FBS； • Protocol： • 取拔除的正畸牙或阻生牙（年龄小者较佳），置于培养皿中，用手术刀仔细刮除附着在牙根上的牙龈组织，然后用PBS反复冲洗，以去除残余组织以及牙根表面的血细胞； • 将牙放入离心管，加入胶原酶2－3ml/牙，37℃，1小时； • 加入等量培养液，仔细吹打牙根表面，收集细胞，离心，重悬，接种，牙/6well； • *培养获得的细胞是牙周膜细胞和成牙骨质细胞的混合体!

40. 年龄对细胞产量以及活力影响较大，最好选用年龄在10－14岁之间的正畸牙或阻生牙；年龄对细胞产量以及活力影响较大，最好选用年龄在10－14岁之间的正畸牙或阻生牙； • 如果选用大鼠牙齿作为培养目标，培养液应稍作调整，基本原则是抑制细胞的衰老，具体做法是：适当降低血清浓度（选用进口血清最佳），如果降低血清浓度后，细胞增殖减慢，可加入促进细胞增殖的因子（例如BPE 25ug/ml等）。

41. 巨噬细胞培养 • 巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法如下：1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注入肠内！），2、引颈处死小鼠。3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3－5秒。4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。

42. 5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。7、小心拔出针头，把液体注入离心管。8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10ml Eagle培养基。9、计数细胞。每只鼠可产生20一30×106细胞，其中90%为巨噬细胞。10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用Eagle液冲洗1一2次，再加新Eagle培养液置CO2温箱中。

43. 干细胞（stem cells)的培养 • 概念：来自胚胎、胎儿或成体未分化的具有无限或长期自我维持和自我更新能力的细胞 • 性质：能自我更新 • 能产生许多分化的后裔 • 分类：根据组织来源： • （1）胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES) • （2）成体干细胞（adult stem cell, AS)

44. 胚胎干细胞的培养 • 胚胎干细胞（ES）是指来自胚胎期桑椹胚的卵裂球或胚泡的内细胞团. • 胚胎干细胞培养的主要问题是保持干细胞于为分化状态。通常是将胚胎干细胞种植在铺有一层经丝裂霉素C处理的成纤维细胞（饲细胞）上或在细胞培养液中加入白血病细胞生长抑制因子（LIF）以防止ES细胞分化。

45. ES的生物学特性 • ES细胞在体外分化抑制培养基中呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形式鸟巢，细胞界限不清，克隆周围可见有单个的ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。 • ES细胞为正常的二倍体细胞，胞体体积大，胞质结构简单。能检测到早期胚胎细胞中表达的阶段特异性胚胎抗原。

47. 小鼠胚胎干细胞的培养 • （一）材料 • 1、将配种后3.5天小鼠断颈后处死, 剪开腹腔取出子宫角,冲胚液冲洗后,收集胚胎. • 2 培养液：ES培养液 DMEM培养液（高糖） • 3 饲养层细胞 • （二）方法 • 1、将小鼠囊胚随机放入铺有饲养层细胞 的4孔培养板上，每孔一枚，加入5 ml ES培养液 培养

48. 2、培养24、48、72小时分别记录胚胎贴壁细胞的生长行为， 48小时后可见ICM迅速生长。 • 3、4～5天后， ICM长成一簇簇的细胞团且未有分化现象，形似鸟巢状的小鼠细胞团衍生物。用无菌玻璃针拨动，使其与滋养层细胞分开，将细胞用胰酶消化成单个细胞。 • 4、将细胞重新接种在铺有饲养层细胞 的培养板。

49. 干细胞系的培养 • 步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。

50. 细胞传代建议每2天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。1．去除培养液；2．无钙镁PBS（Gibco）洗涤；3．加入胰酶EDTA（Gibco）。37℃孵育5分钟。4．加入ES培养基使胰酶失活；5．将细胞转入15 ml离心管中离心3min；6．去除上清，将细胞重悬于2 ml ES培养基，至少吹打10－20次。