流式细胞仪分析技术及应用

流式细胞仪 分析技术及应用

什么是流式细胞术(FCM)？ FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。

特点: 单细胞的流动的活细胞的定量的多参数的高统计学精度的分选细胞

第一节流式细胞仪的分析及分选原理 第二节数据的显示与分析第三节流式细胞仪分析的技术要求第四节流式细胞术在免疫学检查中应用

第一节流式细胞仪的分析及分选原理 一工作原理： FCM是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。

(一）基本组成构 1、液流系统样品流和鞘流 2、光学系统激光、透镜组、光电倍增管等。 3、数据处理系统

1、液流系统 样品流和鞘流 Injector Tip Sheath fluid 荧光信号激光束

2、光学系统 激光、透镜组、光电倍增等。 PMT 4 PMT Dichroic 3 Flow cell Filters PMT 2 Bandpass Filters PMT 1 Laser

（二）基本工作原理

单细胞流：流动室

单细胞照明：激光 488 nm laser

单细胞检测：信号处理 488 nm laser

二散射光的测定 （一）前向散射光 (foword scatter)：FSC 信号的强弱与细胞的大小相关（二）侧向散射光（side scatter)：SSC 信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关

Forward Angle Light Scatter Laser FALS Sensor 细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.

90 Degree Light Scatter Laser FALS Sensor 90LS Sensor 细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.

前向散色光FSC

侧向散色光SSC

散射光的测定 利用前向角和测向角散射光可以把外周血白细胞分成三群，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。

三荧光测量 荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长（一）光信号测量线性放大器对数放大器

350 457 488 514 610 632 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Common Laser Lines PE-TR Conj. Texas Red PI Ethidium PE FITC cis-Parinaric acid

Emisson Excitation 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm DNA

（二）荧光补偿 利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”

四细胞分选原理 + （一）分选的基本原理 FALS Sensor 488 nm laser Fluorescence detector - Charged Plates Single cells sorted into test tubes

MACS-Magnetic Cell Sorting 磁珠分离 阳性选择阴性选择

（二）分选的技术要求 1 、分选速度：几千个细胞/秒 2 、分选纯度:99.5%左右 3 、分选收获率:90-95% 4 、分选得率

分选纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。分选收获率是指分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。

第二节数据的显示和分析 一、参数前向散射光FS:反映颗粒的大小侧向散射光SS:细胞内部结构复杂程度荧光FL:细胞被染上荧光部分数量的多少

二、数据的显示方式 （一）单参数直方图（二）双参数显示（三）三参数显示

(一) 单参数直方图的显示 Single-Parameter Histogram Displays 以分布直方图( distribution histogram ) 来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。

X轴表示绿荧光信号(CD3)强弱,Y轴则反应细胞的数量.X轴表示绿荧光信号(CD3)强弱,Y轴则反应细胞的数量.

(二)双参数数据的显示 Two-Parameter Data Displays 细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双参数数据显示最常用的是二维的散点图( Dot Plot )。在二维图上，横轴代表第一个测量参数，纵轴代表第二个测量参数。

1 、点图 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,在图中每一个点代表一个细胞

2 、二维等高图 用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。

3 、假三维等高图 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。

(三) 三参数直方图 三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。

（四）流式细胞仪的多参数分析 一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate) 技术，来分析参数之间的相互关系。

1 、Region设置

2 、设置 Gate

第三节流式细胞仪免疫分析的技术要求 样品制备：单细胞悬液特定荧光染料的选择：光谱重叠阴性对照的设置:检测标本的重复性质量控制

一、免疫检测样品制备 细胞碎片细胞团块离心漂洗固定剂

（一）外周血淋巴细胞样品的制备 淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。 Ficoll,40kd，高密度，低渗透压，无毒性。（比重为1.0177±0.001的分层液).

利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血 中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图

（二) 培养细胞的样品制备 单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备成单细胞悬液。

(三)新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。化学试剂处理法：EDTA、EGTA等。表面活性剂处理法：Triton-100、皂素等。

机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片的干扰。酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成份的不良影响。FCM所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光染色处理不受影响。

(四）单细胞悬液的保存 防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法： 1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。 2、乙醇与甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。 3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但细胞表面荧光染色分析不受影响。

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