細胞分裂與 DNA 複製

1. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

2. 細胞分裂和繁殖不一定相同 • 在許多的植物與真菌中，一大群聚集的細胞也許會終止活動，或者親代生物體會釋放單細胞的孢子，成長為個別新的多細胞生物體。新的個體與親代遺傳具有相同的特性，稱為無性(asexual) 或營養繁殖(vegetative reproduction)。相較於有性 (sexual) 繁殖，每個細胞從兩個分別的親代得到大致相等的遺傳訊息，因此基因有新的組合。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

3. 細菌在沒有細胞分裂時，且牽涉到相似的DNA小片段從一個細胞 (供應者；the donor) 往另一個細胞 (接受者；the recipient) 的輸送。這種DNA的側向輸送 (sideways transfer)，發生在同一世代的細胞間，被認為是水平的基因傳播 (horizontal gene transmission)。相反的，垂直基因傳播 (vertical gene transmission) 為基因從之前的世代傳到下個新的世代。因此垂直傳播包含了細胞分裂的所有形式與繁殖，可創造一個新的複製基因體，不論是有性或無性。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

4. DNA複製發生在複製叉上，是一種兩階段的過程 • 複製(replicaion) 為一種始祖細胞的DNA加倍的過程，發生於細胞分裂之前。細胞分裂時，每一個子代會得到一份完整的複製DNA，與原本親代的遺傳物質相同。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

5. 複製叉是DNA複製時，酵素解開DNA結構時，結合在已解開的單股DNA的區域。兩條新的DNA股合成都在複製叉(replication fork) 上，此交叉點會沿著親代DNA移動。 • 複製叉包含DNA分開的區域，再加上負責合成的蛋白質集合，有時稱為複製體(replisome)。複製的結果為兩個雙股DNA，而且序列都與原來的相同。子代細胞其中一個有原本細胞左邊的一股，另一個具有原本細胞右邊的一股。複製是採半保留的(semi-conservative) 方式，因為每個子代都保留一半原來的DNA物質。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

6. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

7. 超螺旋引起複製的問題 • 超螺旋的細菌染色體為環狀的，而且兩個複製叉以相對的方向繞著環狀進行作用 。這過程就是雙向複製(bi-directional replication)。環狀的DNA分裂時，中間會出現像希臘字母θ(theta) 的構造，所以這種模式也稱作θ複製(theta-replication)。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

8. 在大腸桿菌中有兩種第二型拓樸異構酶，即DNA促旋酶(DNA gyrase) 與拓樸異構酶IV (topoisomerase IV)，影響了DNA的複製。 • DNA促旋酶會結合在複製叉的前端DNA上，引起可以取消正螺旋的負螺旋。淨結果 (net result) 為DNA促旋酶移除複製叉前面的超螺旋結構。拓樸異構酶IV在過程中或其他方面有協助的作用，但主要的功能，是解開複製完成後的子代DNA物質。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

9. 喹啉酮(quinolone) 抗生素利用在第二型拓樸異構酶上的作用，抑制了細菌DNA的複製，特別是DNA促旋酶。受到抑制的DNA促旋酶仍然結合在DNA的位置上，並且阻止複製叉的移動，而整個反應的結果為導致細胞死亡。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

10. 雙股分離在DNA合成之前 • 雙股螺旋構造會自動地被DNA解旋酶(helicase) 解開。大腸桿菌最主要的解旋酶，是形成六合體 (hexamer) 的蛋白質DnaB。解旋酶不會損毀DNA，只是干擾維持鹼基聚合在一起的氫鍵。此過程需要能量的供應，而能量由解旋酶降解ATP所提供。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

11. 親代DNA分離的兩股為互補，所以可互相配對。為了製造出新的股，原來的兩股必須分離，當作模板使用。這工作由單股結合蛋白質(single strand binding protein; SSB protein) 來完成。此蛋白質可以結合在未配對的單股上，避免兩段原來股重新黏合。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

12. DNA聚合酶的特性 • 聚合酶(polymerase) 為一種可以將核苷酸聚集在一起的酵素。細菌細胞包含幾種DNA聚合酶，對DNA複製與修復有不同功能。有關DNA複製的問題根源於DNA聚合酶(DNA polymerase) 的特性，此酵素負責製造新的DNA。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

13. DNA聚合酶利用其他酵素製造的短片段的RNA引子，去起始新股的合成。與DNA聚合酶不同的RNA聚合酶(RNA polymerase) 可以起始新股的合成。 • 一個特殊的RNA聚合酶，如引發酶(primase)；蛋白質DnaG，在細菌DNA合成製造期間，主要負責起始DNA股合成的RNA引子。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

14. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

15. 核苷酸的聚合 • 不論是DNA或RNA，所有核苷酸的合成方向皆為5’- 至3’-。外加進來的核苷酸會附在3’-的羥基 (hydroxyl group) 上。 • DNA合成的前驅物質為去氧核糖核苷三磷酸或稱為去氧核糖核苷酸(deoxyribonucleoside 5’-triphosphate; deoxy-NTP)，包含dATP、dGTP、dCTP和dTTP。從去氧核糖的外部與功能區分，可以分為 α、β與γ磷酸根。當聚合時，α 與β磷酸根之間的高能鍵結會被分開，釋出能量驅使聚合作用的進行。最外邊的兩個鄰酸根 (β與γ磷酸根) 會以焦磷酸根 (pyrophosphate) 的形態釋出。新的鍵結會在外加核苷酸最裡面的磷酸根 (α磷酸根) 形成，且增長在DNA尾端，先前核苷酸的3’-OH也會有鍵結的形成 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

16. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

17. 供應DNA合成的前驅物質 • DNA前驅物質包含去氧核糖，是由相對應的含核糖的核苷酸所合成的。 • 核糖核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase) 催化，使核糖 (ribose) 還原成去氧核糖 (deoxyribose)。這方面也作用在雙磷酸根的衍生物 (ADP、GDP、CDP和UDP)。激酶(kinase) 稍後會在dADP、dGDP、dCDP上加入第三個磷酸根，形成dATP、dGTP、dCTP。dUDP則有不同的安排，DNA沒有包括尿嘧啶 (uracil)，但包含另一含有甲基的衍生物胸腺嘧啶 (thymine)。在甲基化 (methylation) 進行之前，dUDP會先移除一個磷酸根，轉變成dUMP。然後胸苷酸合成酶(thymidylate synthetase) 加入一個甲基，所以dUMP會轉變成dTMP。最後兩個磷酸根加入，形成dTTP。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

18. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

19. 胸腺嘧啶的甲基由輔助因子 (cofactor) 四氫葉酸(tetrahydrofolate; THF) 攜帶，而四氫葉酸會在反應中氧化成二氫葉酸(dihydrofolate; DHF)。DHF必須還原成THF，當作DNA合成用。參與作用的酵素為二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase)，在細菌中會被抗生素三甲氧二胺嘧啶(trimethoprim) 所抑制。除此之外，合成嘌呤類物質，如腺嘌呤 (adenine) 和鳥糞嘌呤 (guanine)，也需要THF攜帶單碳的物質。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

20. 真核的二氫葉酸還原酶會被甲氨喋呤(methotrexate; amethopterin) 所抑制。因為腫瘤的生長會影響癌症細胞的快速分裂與DNA複製，因此甲氨喋呤常被用來做抗癌藥劑。 • 磺胺(sulfonamide) 類的抗生素會主動抑制葉酸(folate) 輔助因子的合成。動物體不能合成葉酸，但在飲食中必須攝取，所以在合理的劑量下，磺胺為無害的。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

21. DNA聚合酶延長DNA單股 • DNA 聚合酶 III (polymerase III, Pol III) 是重要的酵素，主要是在染色體複製期間牽涉到DNA的延長。 • 滑動鉗子(sliding clamp) 由兩個半圓形的DnaN蛋白質次單元組成。它像一個門簾包圍著DNA模板股到處滑動，而且需要其他不同的蛋白質 (如HolA、B、C和D，再加上 γ 次單元)，這就是所謂的鉗子裝載複合物(clamp-loading complex) 裝載這個滑動鉗子 (sliding clamp) 到DNA上。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

22. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

23. 「滑動鉗子」會形成巨大複雜的核心酵素(core enzyme) 到DNA上。核心酵素可合成DNA，包含三個小次單元，DnaE (α-次單元；聚合化)，DnaQ (ε-次單元；校正) 和HolE (θ-次單元；功能未知)。兩個核心結合後，其中一個主要負責製造新的DNA股，是利用一對 t (tau) 次單位連接在一起。單一鉗子裝載複合物被兩個核心結合後共享。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

24. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

25. 許多DNA聚合酶具有動力學校正(kinetic proofreading) 的功能。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

26. 複製叉是複雜的 • 複製叉被定義為，在DNA分子被複製的這個範圍中所有結構的組成。它包括DNA被DNA促旋酶 (gyrase) 和解旋酶 (helicase) 解開的區帶，也包括單股DNA延伸中，去幫助維持單股的單股結合蛋白質 (SSB)。它也包括兩個DNA聚合酶 III分子，這也製造出兩個新的DNA雙股。領導股持續地被製造出，而延遲股是製造成一段段1000～2000鹼基長的小片段，這就是所謂的岡崎片段(Okazaki fragments)。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

27. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

28. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

29. DNA間斷的合成需要一個引發體的蛋白複合體 • 當每一個岡崎片段開始進行時，就必須要有RNA引子。在開始進行時，priA蛋白質取代SSB蛋白質，這個蛋白質有義務的去結合未配對的DNA，使 (DnaG) 引發酶(primase) 能夠捆住延長中的DNA。引發酶能夠製造出約11～12鹼基長的RNA引子。這個初期所形成的複合體，有時被稱作引發體(primosome) 的蛋白質複合體。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

30. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

31. 延遲股的完成 • 連接岡崎片段形成完整的DNA需要2或者3酵素，接替順序為：核糖核酸酶H (ribonuclease H, RNase H)、DNA聚合酶 I (DNA polymerase I, Pol I) 與DNA接合酶(DNA ligase)。 • DNA聚合酶 I會分解RNA引子，且會利用分解的RNA來填滿缺口，最後DNA 接合酶連結尾端。RNA雙股螺旋中的RNA股，會移除每個RNA引子，而且DNA聚合酶 I只會移除RNA引子的最後幾個鹼基。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

32. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

33. DNA聚合酶 I具有像Pol III的動力學校正 (kinetic proofreading) 能力。 • DNA聚合酶 I起始於斷股缺口，然後沿著DNA移位，並切開核苷酸的5’-端方向，再用放射性核苷酸來取代。而DNA聚合酶 I和DNA接合酶，在遺傳工程扮演很重要的角色。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

34. 染色體複製起始於oriC • 原核染色體DNA複製時，起始在染色體一個特別的地方，我們稱作複製起始點(origin of replication)，在環狀的兩個方向進行。 • 這個起始複合物(initiation complex) 包括5個蛋白質：DnaA、DnaB、DnaC、促旋酶和SSB。這些只有DnaA有一個特別的染色體起始點，其餘的只牽涉到新合成的岡崎片段。這個起始點即oriC，有三次13-鹼基重複 (13-base repeat)，這些鹼基包括GATCTNTTNTTTT，接著是四次9-鹼基重複，為TTATNCANA。這些序列都有AT-rich，是這些序列的特色，有助於分辨這些序列。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

35. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

36. 首先，DnaA蛋白質(DnaA protein) 和四次的9-鹼基重複結合。約有30個叢聚的DnaA蛋白質結合在oriC，並且纏繞它們。 • 接下來，DnaA蛋白質打開DNA所有的三次13-鹼基重複區域。 • 六次方體的DnaB解旋酶，加入伴隨著6個DnaC蛋白質，需要裝載DnaB蛋白質到DNA上。然後DnaB蛋白質從三次13-鹼基重複區域中取代了DnaA蛋白質，並開始解開DNA而產生了複製叉。第二個DnaB蛋白質六次單元，也產生了一個複製叉，往相反的方向移動。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

37. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

38. DNA甲基化和附著到細胞膜可以控制複製初始 • 控制複製初始，DNA的甲基化在初始位置和附著到細胞膜。這個oriC區域包含全部11個可以被Dam甲基酶辨識的GATC序列。這些迴文的 (palindromic) 區域被Dam甲基酶甲基化在DNA雙股上的腺嘌呤。在複製前，每一個GATC在大腸桿菌染色體上，包括這些初始的複製區域，將被完全甲基化。複製之後立即將先前的DNA股甲基化，但新合成的DNA股還未甲基化。因此DNA是半甲基化的 (hemi-methylated)。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

39. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

40. 當在半保留甲基化的時候基因的轉錄被抑制，初始複製反應時整體的DnaA蛋白量減少。半甲基化位置不可以使用在初始複製反應。半保留甲基化DNA會藉由隔離蛋白A (SeqA, sequestration protein) 的幫助，結合到細胞膜上，而完全甲基化的DNA則不會。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

41. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

42. 染色體複製結束在terC • 當兩個複製叉遇到染色體的終點(terminus)，複製結束。這區域附近有許多終點位置(Ter site)，防止複製叉前進移動 。TerC、TerB、TerF防止複製叉以順時針方式移動，而TerA、TerD和TerE防止複製以逆時針針方式移動。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

43. 鬆開子代染色體 • 將連成鎖狀的環進行反連鎖 (decatenation)，需要拓樸酶IV作用。 • 拓樸酶IV在複製叉的後方被發現，當複製進行時可以鬆開新合成的DNA。拓樸酶IV也可以解開完成複製的環狀體，如染色體或質體DNA。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

44. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

45. 在染色體複製後才發生細菌細胞分裂 • 細菌的細胞分裂相對來的簡單，並且簡易分成四個時期。 • 複製染色體。 • 分開子代染色體。 • 細胞延長。 • 形成細胞壁，分離兩個子代細胞。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

46. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

47. 細菌花了多少時間進行複製 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

48. 複製子的概念 • 複製子(replicon) 是在細胞中任何的DNA (或RNA) 分子，能夠存活和自我複製。 • 伯氏疏螺旋菌 (Borrelia burgdorferi)，造成萊姆症(Lyme disease)，它有直線狀染色體的末端髮夾狀序列。變鉛青鏈黴菌 (Streptomyces lividans)，一種土壤中的生物體，有蛋白質以共價鍵的結合至染色體末端。 • 質體(plasmid) 是另一群的複製子 (replicons)。它們是屬於多餘的自我複製分子，對於宿主細胞生存是不需要的 。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

49. 在真核細胞中複製直線狀DNA • 雖然DNA聚合酶只可以延長，而非初始，但新合成的DNA複製初始必須有RNA引子輔助。因為合成DNA的方向是從5’- 到3’-，當線狀的DNA複製時，每個RNA引子必須正確位於5’-末端的每個新合成DNA股。當末端RNA引子被移除時，RNA引子結合的位置不會有DNA取代，DNA聚合酶不會結合在此位置並做延長。如果沒有辦法去解決這樣的問題，每回合複製時，DNA分子將縮短一個RNA引子長度。環狀原核細胞DNA分子，沒有末端所以沒有這樣的問題。 • 真核細胞為適應這樣複製線狀DNA問題，發展出一套位於染色體尾端稱為端粒(telomere) 的構造。 CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製

50. CHAPTER 5 細胞分裂與DNA複製