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综合化学实验 - 化学生物学专题实验二. 铜配合物氧化断裂 DNA 研究. 巢 晖. 中山大学化学与化学工程学院 电话： 84134058 E-mail: ceschh@mail.sysu.edu.cn. 实验目的. 了解化学核酸酶 了解断裂 DNA 的途径 掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的使用方法. 化学核酸酶. Sigma 把生理条件下借助于氧化或光活化产生活性氧中间产物导致核酸骨架断裂，即显示出与天然核酸酶相同或类似生物活性的过渡金属配合物及其载体衍生物称为化学核酸酶。
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综合化学实验-化学生物学专题实验二 铜配合物氧化断裂DNA研究 巢 晖 中山大学化学与化学工程学院 电话：84134058 E-mail: ceschh@mail.sysu.edu.cn
实验目的 • 了解化学核酸酶 • 了解断裂DNA的途径 • 掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的使用方法
化学核酸酶 • Sigma把生理条件下借助于氧化或光活化产生活性氧中间产物导致核酸骨架断裂，即显示出与天然核酸酶相同或类似生物活性的过渡金属配合物及其载体衍生物称为化学核酸酶。 • 化学核酸酶既有限制性内切酶的高度专一性，又能在人们预先设计的任何位点断裂DNA，而且克服了传统的限制性内切酶识别位点仅为4～8个核苷酸的限制，还具有分子小、结构简单、易于提纯、成本低等优点。 • 可用于基因分离、染色体图谱分析、大片段基因的序列分析以及DNA定位诱变、肿瘤基因治疗与新的化学疗法等领域。
DNA断裂的途径 • 水解断裂DNA。仅影响磷酸二酯键，不造成碱基和核糖环损伤。 • 氧化断裂DNA。以氧化作用攻击DNA的核糖环及碱基，产生各种氧化物，可以直接引起DNA的单链或双链发生断裂。 • 光断裂DNA。化合物通过光反应产生多种氧化性的自由基，如超氧阴离子（O2–），超氧自由基（OOH）或羟基自由基（OH）等。这些物质都能够氧化DNA的鸟嘌呤碱基，从而使DNA发生断裂。
琼脂糖凝胶 天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose ，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。
电泳实验原理 • DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 • 核酸为两性分子，在pH3.5时，整个分子带正电；pH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 • 可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。 • 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 • 共价闭环超螺旋DNA（ccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。
溴化乙锭 (Ethidium Bromide, EB) • EB能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。 • EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中可胶中。 • EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。
实验内容 • [Cu(phen)2(H2O)](ClO4)2的制备 • 铜配合物氧化断裂 DNA • 琼脂糖凝胶的制备 • DNA氧化断裂的检测
实验试剂 • 质粒pBR322 DNA • [Cu(phen)2(H2O)](ClO4)2 • Tris 缓冲液1000 mL：称Tris 6.057 g (50 mM), NaCl 1.052 g (18mM), 再用盐酸调节酸度到pH = 7.2。 • 溴酚蓝指示剂点样缓冲液： 10 mL（甘油5 mL, Tris2缓冲溶液5mL，溴酚兰 0.0251 g，EDTA 0.186 g，pH＝8；2） • 1 g/ml溴化乙锭溶液 (琼脂糖凝胶染色用) • 电泳缓冲液（TAE）：40mmol/L Tris-乙酸，1 mol/L EDTA (配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml） • 0.8% 琼脂糖凝胶（配制方法：称取琼脂糖0.4克，加入50ml TAE电泳缓冲液）。
实验仪器 • 电磁搅拌器 • 恒温水浴锅 • 微量移液器 • 电泳仪 • 水平电泳槽 • 透射紫外观察仪
实验内容一：铜配合物制备 将Cu(ClO4)2.6H2O (270 mg, 1.0 mmol) 和1,10-邻菲咯啉 (phen) (360 mg, 2.0 mmol) 加入15 ml甲醇中, 25 oC下电磁搅拌半小时, 产生的绿色沉淀经减压抽滤并用少量的冷甲醇淋洗后, 再用P2O5真空干燥. (参见文献：G. Murphy, C. Murphy, B. Murphy, B. Hathaway, J.Chem. Soc., Dalton Trans., 1997, 2653)
实验内容二：铜配合物氧化断裂DNA 首先用Tris缓冲液配置[Cu(phen)2(H2O)](ClO4)2溶液（200 M，为使样品溶解，可加入不超过总体积10%的DMF）和抗坏血酸溶液(0.1 mM）。在排列固定好的样品管里，依次用微量取液器加入1 μL 稀释5倍的pBR322 DNA原液、[Cu(phen)2(H2O)](ClO4)2 (5 μL）和抗坏血酸 (1 μL），再用Tris缓冲液把所有样品都补到10 μL（另外要有一个DNA的空白）。37 oC下温育1小时后，每个样品管里加点样液2 μL，上样，进行琼脂糖凝胶电泳。
实验内容三：琼脂糖凝胶的制备 • 选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负极的线路。 • 选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。 • 制备1%琼脂糖凝胶，100℃水浴加热至琼脂糖融化均匀。 • 用吸管取少量琼脂糖凝胶溶液将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，加入一滴溴化乙锭，摇匀，轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3～5mm。倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。 • 琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端的挡板，保持点样孔的完好。 • 将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面1～2mm。如点样孔内有气泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。
实验内容四：DNA氧化断裂的检测 • 将实验二得到的反应液样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。上样缓冲液不仅可以提高样品的密度，使样品均匀沉到样品孔内，还可以使样品带颜色，便于上样和估计电泳时间和判断电泳的位置。 • 用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。 • 盖上电泳槽，开启电源开关，最高电压不超过5V/cm（100～150V恒压电泳），使DNA从负极向正极移动。从电泳槽中取出凝胶，将凝胶置于1 ug/ml溴化乙锭水溶液中，室温下振摇染色30~45分钟。回收染色液，自来水冲洗凝胶后，于紫外灯下观察。 • 电泳时间随实验的具体要求而异。电泳一般需1～3小时。电泳完毕后关闭电源，戴一次性塑料手套取出凝胶，尽可能将所有的电泳缓冲液淋干，在254nm波长的透射紫外灯下观察。
参考文献 • Sigman D. S., Mazumder A. Perrrin D. M. Chem. Rev. 1993, 93, 2295 • Sigman D. S., Acc. Chem. Res., 1986, 19, 180. • Detmer III C. A., Pamatong F. V., Bocarsly J. R., Inorg. Chem., 1996, 35, 6292. • 刘长林，周井炎，徐辉碧，无机化学学报，1998，3，253. • Steenken S., Jovanovic S., J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 617. • Hazlewood C., Davies M. J., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1995, 895. • Chakravartya A. R., J. Inorg. Biochem., 2002, 89, 191. • Wang X. L., Chao H., Li H., Hong X. L., Ji L. N., Li X. Y., J. Inorg. Biochem., 2004, 98, 423.
思考题 1. 抗坏血酸在实验中起什么作用？类似的还有哪些化合物？ 2. 溴乙啶在DNA琼脂糖电泳中起什么作用？ 3. DNA断裂除了氧化断裂途径外,其它途径还有哪些?
