生科0801 黄开松

1. 生科0801 黄开松

2. 克隆基因的表达 目前有5套发展成熟的表达系统 1在大肠杆菌中表达 2在哺乳动物细胞中表达 3在酿酒酵母中表达 4在枯草芽孢杆菌中表达 5在培养的昆虫细胞中表达

3. 在大肠杆菌中表达克隆化基因 • 选择合适 启动子和载体系统 1带IPTG诱导启动子的表达载体 例如tac trc lac 启动子 (pUC,pTZ,pSK,pGEM等） 2 含T7噬菌体启动子的表达载体（例如pET系列载体） 外源基因表达受T7噬菌体RNA聚合酶调控，具有氨苄或者卡 那抗性，多克隆位点置于T7噬菌体RNA聚合酶启动子之后 3 带有&噬菌体PL 启动子的表达载体（ pPLc系列 pKC30 等） 受温度敏感性阻抑物cIts857调控，低温时能抑制PL 驱动的转录，高温不能 4 用碱性磷酸酶启动子（phoA）和信号序列

5. pET系统对T7RNA聚合酶水平和靶基因转录实行多层次调控 pET系统对T7RNA聚合酶水平和靶基因转录实行多层次调控

6. 目标蛋白在大肠杆菌里大量表达后我们却面临着怎样高效简易收集纯化活性目的蛋白的问题目标蛋白在大肠杆菌里大量表达后我们却面临着怎样高效简易收集纯化活性目的蛋白的问题 • 宿主蛋白酶降解 • 形成不溶性包涵体 • 无法分泌到特定的细胞区 • 目的蛋白无法从细胞裂解液里得到有效的分离 解决方法？？ 融合蛋白 融合两个基因的开放阅读框 将靶蛋白连接在运载蛋白的氨基或羧基端

7. 一般融合载体图解

8. 构建融合蛋白的载体

9. 融合蛋白里的伴侣蛋白(运载蛋白)高亲和力的与特定配基结合，使得纯化融合蛋白 ，一步就可以达到目的

10. 融合蛋白的亲和纯化

11. His Tag纯化操作实例原理 • 当亲和层析柱负载了Ni2+后，可以选择性吸附暴露在蛋白表面具有复杂结构的氨基酸残基（特别是组氨酸残基）。蛋白质中含有的组氨酸越多，与Ni2+结合的特异性就越高，则将其洗脱下来会需要更高的咪唑浓度。含有组氨酸标签的目标蛋白与细胞中的总蛋白相比，具有更高的Ni2+结合特异性。为了得到具有较高纯度的目标蛋白，必须找到一个合适咪唑浓度的洗脱液（结合缓冲液），在此浓度下非特异性的杂蛋白能从柱上洗脱下来，而与Ni2+特异性结合的目标蛋白不会被洗脱。最后用更高咪唑浓度的缓冲液（洗脱缓冲液）将目标蛋白洗脱下来，此时目标蛋白特异性的存在于该咪唑浓度的洗脱液中，从而得到纯化了的目标蛋白质。

12. 融合蛋白的切割得到靶蛋白 • 化学方法 特异性识别特定的氨基酸残基或者一组氨基酸残基 例如 氰溴化物在Met残基后切割，甲酸在Asp-Pro后切割 • 酶学方法 在靶蛋白和运载蛋白连接区设计特异酶解位点 Xa因子， 胰酶 ，肠激酶，凝血酶，胶原酶，TEV蛋白酶等等

13. 不溶性形成包涵体蛋白的处理 • 破碎（超声 压力 冻融 溶菌酶） • 低温低速离心，用含EDTA,变性剂，DNase洗涤出去杂蛋白和核酸 • 溶解再折叠 在强的离液剂下 体外折叠形成有天然或近天然构象，恢复活性 蛋白质在大肠杆菌中高水平表达时，易形成相差显微镜下可见的细胞质颗粒或包涵体包涵体很容易与可溶性的蛋白和膜结合蛋白分离

14. 以pET-28a（+）表达载体，克隆受体菌为E.coliDH5α，表达宿主为E.coli BL21(DE3)为例简单介绍实验过程 • 构建重组表达载体 1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 （2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。连接反应体系为： pRSETA 1μl R基因片段 3μl T4 DNA连接酶（5U/μl） 1μl 5×buffer 2μl 3、获得含重组表达质粒的表达菌种 （1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗kan）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 （2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 （3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21（DE3）的感受态细胞

15. 重组蛋白的诱导 （1）挑一个转化重组质粒的单菌落接种于LB液体培养基中（含100μg/m卡那霉素和），于37℃过夜培养。 （2）取1ml过夜培养物，转接于100ml含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃培养1.5～2小时至对数生长期。 （3）在培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.2 mM，按照预先建立的最佳表达条件进行诱导表达。 （4）1200 rpm，离心2min，收集菌体。 （5）弃上清，向沉淀中加入500ml Starting buffer（20mM磷酸缓冲液（Na2HPO4和NaH2PO4），200mM NaCl，10%甘油，pH 7.0），充分悬浮洗涤菌体。 （6）12000 rpm，离心2min，收集菌体。 （7）向沉淀中加入15ml的starting buffer，重悬菌体。 （8）冰浴条件下超声波处理3min，每处理30sec间隔1min使菌液冷却，输出强度为5～6，频率为60～70％，处理时以不发生气泡，不过热为准，以菌液变清晰为终止标准。 （9）12000 rpm，4℃离心20min，将上清移到干净灭过菌的50ml离心管。SDS-PAGE分析蛋白的表达情况。若目的蛋白分布在上清中，继续进行下面的纯化操作

16. 目标蛋白的体外纯化 （1）灌制好Ni2+-NTA亲和层析柱，用去离子水进行缓慢洗脱，避免在柱床中引入气泡。 （2）用10倍柱床体积的starting buffer进行预平衡，上样，将细胞破碎后的上清液注入Ni2+-NTA亲和层析柱中。 （3）用10倍ml的starting buffer进行漂洗，收集滤过液。 （4）开始用5倍柱床体积的含20 mM咪唑的starting buffer进行洗脱，并对洗脱液进行收集。 （5）依次用5倍柱床体积的含40 mM，60 mM，80 mM，100 mM，200 mM，300 mM和500 mM咪唑的starting buffer进行洗脱，分别对洗脱液进行收集。 （6）通过SDS-PAGE检测回收的效果，确定咪唑最合适洗脱浓度。 （7）从每管收集的滤出液取出10μl的样品，加入10μl的2X SDS凝胶加样缓冲液，摇匀。 （8）沸水浴处理3min。 （9）取出样品，将10μl样品全部上样于适当浓度的SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳。