第十章细胞增殖

第十章细胞增殖 狭义的细胞生长：细胞大小的增加广义的细胞生长：还包括细胞分裂和细胞分化细胞增殖：指细胞的增加或繁殖，是经过多次细胞分裂而使细胞数量快速膨胀的过程

第一节细胞周期的概念 一、什么是细胞周期细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。可分为四个阶段： ①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到DNA复制之前的间隙时间； ②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期，只有在这一时期H3-TdR才能掺入新合成的DNA中； ③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间； ④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。分裂间期分裂期

① 周期中细胞（cycling cell）：是指在细胞周期中连续运转的细胞，有丝分裂活性高，又称为连续分裂细胞或可育细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞、造血干细胞、雄性个体的生精细胞等。 ② 静止期细胞（quiescent cell）：指的是暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行一定的生物学功能，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期的细胞，又称为G0期细胞或休眠细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。 ③ 终末分化细胞：指不可逆地脱离细胞周期，丧失分裂能力，保持生理机能活动的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞、红细胞等。

细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。

细胞周期长短的测定 • 同种细胞间周期时间长短相似或相同；不同种类细胞间，周期长短差别很大。 • S+G2+M 的时间变化较小，细胞周期时间长短差别在G1期。 • 部分细胞的细胞周期没有G1、G2期。

细胞周期长短的测定方法 • 标记有丝分裂百分数法（percentage labeled mitoses，PLM） • 流式细胞分选仪测定法(Flow Cytometry) • 缩时摄像技术

标记有丝分裂百分数法（PLM) 原理：是一种常用的测定细胞周期时间的方法。其原理是对测定细胞进行脉冲标记、不同时间取样做细胞放射性自显影，找出正处于有丝分裂的分裂期细胞，计算其中带3H标记的细胞占有丝分裂细胞的百分数。优点：可以测定细胞周期的总时间和各阶段的时间，结果明了易分析。缺点：操作技术有一定的难度；具有一定的危险性；同位素的放射性逐渐衰减，误差较大。

测定原理： ① 待测细胞经3H-TdR标记后，所有S期细胞均被标记。 ② S期细胞经G2期才进入M期，所以一段时间内PLM=0。 ③开始出现标记M期细胞时，表示处于S期最后阶段的细胞，已渡过G2期，所以从PLM=0到出现PLM的时间间隔为TG2。 ④ S期细胞逐渐进入M期，PLM上升，到达到最高点的时候说明原先才进入M期的细胞，已完成M，进入G1期。所以从开始出现PLM到PLM达到最高点（≈100%）的时间间隔就是TM。 ⑤ 当PLM开始下降时，表明处于S期最初阶段的细胞也已进入M期，所以出现PLM到PLM又开始下降的一段时间等于TS。 ⑥ 从PLM出现到下一次PLM出现的时间间隔就等于TC，根据TC=TG1+TS+TG2+TM即可求出的TG1长度。

细胞周期各阶段的时间与PLM的关系 Ts

二、细胞周期同步化 概念：细胞同步化是指在自然过程中发生的，或经人为处理造成的细胞周期的同步化。类型：自然同步化人工同步化：选择同步化：有丝分裂选择法细胞沉降分离法诱导同步化：DNA合成阻断法中期阻断法

(一）自然同步化 概念：自然界存在的细胞周期同步过程，称为自然同步化。类型： 1．多核体如粘菌只进行核分裂，而不发生胞质分裂，形成多核体。数量众多的核处于同一细胞质中，进行同步化分裂，使细胞核达108，体积达5~6cm。疟原虫也具有类似的情况。 2．某些水生动物的受精卵如海胆卵可以同时授精，最初的3次细胞分裂是同步的，再如大量海参卵受精后，前9次细胞分裂都是同步化进行的。 3．增殖抑制解除后的同步分裂如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。

（二）人工同步化 1、选择同步化 1）有丝分裂选择法：使单层培养的细胞处于对数增殖期，此时分裂活跃，MI高。有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的附着性低，此时轻轻振荡，M期细胞脱离器壁，悬浮于培养液中，收集培养液，再加入新鲜培养液，依法继续收集，则可获得一定数量的中期细胞。 — 优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物的伤害。 — 缺点：获得的细胞数量少（分裂细胞约占1%～2%）。

2）细胞沉降分离法：不同时期的细胞体积不同，而细胞在给定离心场中沉降的速度与其半径的平方成正比，因此可用离心的方法分离。2）细胞沉降分离法：不同时期的细胞体积不同，而细胞在给定离心场中沉降的速度与其半径的平方成正比，因此可用离心的方法分离。 — 优点：可用于任何悬浮培养的细胞。 — 缺点：同步化程度低。

2、诱导同步化 1）DNA合成阻断法：选用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成，而不影响其他时期细胞的运转，最终可将细胞群阻断在S期或G/S交界处。5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、高浓度ADR、GDR和TDR，均可抑制DNA合成使细胞同步化。其中高浓度TDR对S期细胞的毒性较小，因此常用TDR双阻断法诱导细胞同步化。 ?

TdR 阻断法阻滞细胞周期的原理是: TdR 是细胞DNA 合成不可缺少的前体, 但向培养基中加入过量的TdR, 能形成过量的三磷酸腺苷, 后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化, 从而阻抑DNA合成。

DNA合成阻断法的操作过程 在细胞处于对数生长期的培养基中加入过量TDR，S期细胞被抑制，其它细胞继续运转，最后停在G1/S交界处。移去TDR，洗涤细胞并加入新鲜培养液、细胞又开始分裂。当释放时间大于TS时，所有细胞均脱离S期，再次加入过量TDR，细胞继续运转至G1/S交界处，被过量TDR抑制而停止。

关键：控制时间 第1次阻断时间相当于G2、M和G1期时间的总和或稍长，释放时间不短于S期时间，而小于G2+M+G1期时间，这样才能使所有位于G1／S期的细胞通过S期，而又不使沿周期前进最快的细胞进入下一个S期。第2次阻断时间同第1次，再释放。 HeLa细胞周期时间为21 h，其中G1期为10 h，S期为7 h，G2期为3 h，M期为1 h

优点：同步化程度高，适用于任何培养体系。可将几乎所优点：同步化程度高，适用于任何培养体系。可将几乎所有的细胞同步化。缺点：产生非均衡生长，个别细胞体积增大。 2）中期阻断法（M期抑制法）：利用破坏微管的药物将细胞阻断在中期，常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性较少。优点：无非均衡生长现象；缺点：可逆性较差。

细胞周期中各时期的特征 G1期：细胞表面有泡状物，染色质去凝集；蛋白质、糖类、脂质等开始合成。 S期：细胞表面光滑，小泡和微绒毛明显减少，DNA复制，中心体也在此期完成复制。 G2期：细胞表面许多微绒毛，合成一定数量的蛋白质和RNA。 M期：细胞分裂期，细胞呈球状，表面覆盖微绒毛。

植物细胞的细胞周期 • 植物细胞周期的时相和动物细胞的标准细胞周期相似，都含有G1、G2、S、M期。 • 植物细胞没有中心体，但细胞分裂时可以正常组装纺锤体； • 植物细胞的形态不发生变化，以形成中间板的形式进行胞质分裂。

植物细胞成膜体的形成

细菌的细胞周期 • 慢生长细菌细胞周期过程与真核细胞周期过程有一定相似之处。其DNA复制之前的准备时间与G1期类似。分裂之前的准备时间与G2期类似。再加上S期和M期，细菌的细胞周期也基本具备四个时期。 • 细菌在快速生长情况下，如何协调快速分裂和最基本的 DNA复制速度之间的矛盾？快速生长的细菌，在上一次细胞分裂结束时，细胞内的DNA经复制到一半进程，以保证迅速进行下一次分裂。

第二节有丝分裂 一、细胞分裂的类型细胞分裂(cell division)可分为无丝分裂(amitosis)、有丝分裂(mitosis)和减数分裂(meiosis)三种类型。无丝分裂又称为直接分裂，由R. Remark（1841）首次发现于鸡胚血细胞。表现为细胞核伸长，从中部缢缩，然后细胞质分裂，其间不涉及纺锤体形成及染色体变化，故称为无丝分裂。无丝分裂不仅发现于原核生物，同时也发现于高等动植物，如植物的胚乳细胞、动物的胎膜，间充组织及肌肉细胞等等。

有丝分裂，又称为间接分裂，由W. Fleming (1882)年首次发现于动物及E. Strasburger（1880）年发现于植物。特点是有纺锤体染色体出现，子染色体被平均分配到子细胞，这种分裂方式普遍见于高等动植物。 • 减数分裂是指染色体复制一次而细胞连续分裂两次的分裂方式，是高等动植物配子体形成的分裂方式。

（二）有丝分裂（mitosis） 二、有丝分裂有丝分裂过程是一个连续的过程，为了便于描述，人为的划分为六个时期：间期（interphase）、前期(prophase)、前中期(premetaphase)、中期(metaphase)、后期(anaphase)和末期(telophase)。其中间期包括G1期、S期和G2期，主要进行DNA复制等准备工作。

胞质分裂期 前中期

（一）前期 前期的主要事件是： ①染色质凝缩， ②分裂极确立与纺锤体开始形成， ③核仁解体， ④核膜消失。前期最显著的特征是染色质通过螺旋化和折叠，变短变粗，形成光学显微镜下可以分辨的染色体，每条染色体包含2个染色单体。

前期两个中心体向两极移动

早在S期两个中心粒已完成复制，在前期移向两极，两对中心粒之间形成纺锤体微管，当核膜解体时，两对中心粒已到达两极，并在两者之间形成纺锤体，纺锤体微管包括：早在S期两个中心粒已完成复制，在前期移向两极，两对中心粒之间形成纺锤体微管，当核膜解体时，两对中心粒已到达两极，并在两者之间形成纺锤体，纺锤体微管包括： ①着丝点微管（kinetochore mt）：由中心体发出，连接在着丝点上，负责将染色体牵引到纺锤体上，着丝点上具有马达蛋白。 ②星体微管（astral mt）：由中心体向外放射出，末端结合有分子马达，负责两极的分离，同时确定纺锤体纵轴的方向。 ③极体微管（polar mt或overlap mt）：由中心体发出，在纺锤体中部重叠，重叠部位结合有分子马达，负责将两极推开。有两类马达蛋白参与染色体、分裂极的分离，一类是dynein，另一类是kinesin。植物没有中心粒和星体，其纺锤体叫作无星纺锤体，分裂极的确定机理尚不明确。

（二）前中期 指由核膜解体到染色体排列到赤道面(equatorial plane)这一阶段。纺锤体微管向细胞内部侵入，与染色体的着丝点结合。着丝点处的分子马达使染色体向微管的负端移动。在光镜下可以看到，此时染色体也就是既向一极移动也向另一极移动，是以振荡的方式移向纺锤体中部的。其原因是姊妹染色单体的着丝点都结合有微管和分子马达。

（三）中期 指从染色体排列到赤道面上，到姊妹染色单体开始分向两极的一段时间，纵向观动物染色体呈辐射状排列。染色体两边的牵引力就像拔河一样达到平衡。

牵拉假说：染色体向赤道板方向运动，是由于动粒微管牵拉的结果。动粒微管越长，拉力越大，当来自两极的动粒微管的拉力相等时，染色体被稳定在赤道板上。牵拉假说：染色体向赤道板方向运动，是由于动粒微管牵拉的结果。动粒微管越长，拉力越大，当来自两极的动粒微管的拉力相等时，染色体被稳定在赤道板上。外推假说：染色体向赤道板方向的移动，是由于星体的排斥力将染色体外推的结果。染色体距离中心体越近，星体对染色体的外推力越强，当来自两极的推力达到平衡时，染色体被稳定在赤道板上。

（四）后期 指姊妹染色单体分开并移向两极的时期，当子染色体到达两极后，标志这一时期结束。分为后期A和后期B。

后期可以分为两个方面： ①后期A，指染色体向两极移动的过程。这是因为染色体着丝点微管在着丝点处去组装而缩短，在分子马达的作用下染色体向两极移动，体外实验证明即使在不存在ATP的情况下，染色体着丝点也有连接到正在去组装的微管上的能力，使染色体发生移动。 ②后期B，指两极间距离拉大的过程。这是因为一方面极体微管延长，结合在极体微管重叠部分的马达蛋白提供动力，推动两极分离，另一方面星体微管去组装而缩短，结合在星体微管正极的马达蛋白牵引两极距离加大。可见染色体的分离是在微管与分子马达的共同作用下实现的。

（五）末期 末期是从子染色体到达两极，至形成两个新细胞为止的时期。末期涉及子核的形成和胞质分裂两个方面。

1、子核的形成 末期子核的形成，大体经历了与前期相反的过程，即染色体解聚缩，核仁出现和核膜重新形成。核仁由染色体上的核仁组织中心形成（NORs），几个NORS共同组成一个大的核仁，因此核仁的数目通常比NORs的数目要少。前期核膜解体后，核纤层蛋白B与核膜残余小泡结合，末期核纤层蛋白B去磷酸化，介导核膜的重新装配。

2、胞质分裂 虽然核分裂与胞质分裂（cytokinesis）是相继发生的，但属于两个分离的过程，例如大多数昆虫的卵，核可进行多次分裂而无胞质分裂，某些藻类的多核细胞可长达数尺，以后胞质才分裂形成单核细胞。动物细胞的胞质分裂是以形成收缩环的方式完成的，收缩环在后期形成，由大量平行排列的肌动蛋白和结合在上面的myosin II等成分组成，用细胞松驰素及肌动蛋白和肌球蛋白抗体处理均能抑制收缩环的形成。不难想象胞质收缩环工作原理和肌肉收缩时一样的。

动细胞的胞质收缩环

胞质分裂（cytokinisis）

动物胞质分裂的另一特点是形成中体。末期纺锤体开始瓦解消失，但在纺锤体的中部微管数量增加，其中掺杂有高电子密度物质和囊状物，这一结构称为中体。在胞质分裂中的作用尚不清楚。动物胞质分裂的另一特点是形成中体。末期纺锤体开始瓦解消失，但在纺锤体的中部微管数量增加，其中掺杂有高电子密度物质和囊状物，这一结构称为中体。在胞质分裂中的作用尚不清楚。 • 植物胞质分裂的机制不同于动物，后期或末期两极处微管消失，中间微管保留，并数量增加，形成桶状的成膜体(phragmoplast)。来自于高尔基体的囊泡沿微管转运到成膜体中间，融合形成细胞板。囊泡内的物质沉积为初生壁和中胶层，囊泡膜形成新的质膜，由于两侧质膜来源于共同的囊泡，因而膜间有许多连通的管道，形成胞间连丝。源源不断运送来的囊泡向细胞板融合，使细胞板扩展，形成完整的细胞壁，将子细胞一分为二。

第十章 细胞增殖