Bioinformatique et Biologie Structurale I/ – Principes et techniques

1. Bioinformatique et Biologie Structurale I/ – Principes et techniques A/ L’information structurale B/ Les différentes techniques de détermination de structure C/ Les nouveaux challenges de la biologie structurale II/ – Application à l’étude d’enzymes d’intérêt médical A/ Un bref aperçu de ce que l’on appelle « Drug design » B/ Recherche d’inhibiteurs d’aminopeptidases de Streptocoques C/ Relations structure-fonction d’hélicases impliquées dans les cancers

2. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Activité hélicase • Il en existe de 2 types : les ADN-hélicases et les ARN-hélicases • Les ADN-hélicasessont des enzymes quidéroulent l'hélice d'ADN en 2 brins, • permettant ainsi la replication et la transcription de l'ADN DNA helicase activity

3. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Fonctionnement d’une ADN-hélicase • Les ADN-hélicases sont des protéines ubiquitaires agissant comme des moteurs moléculaires qui exploitent l’énergie libre fournie par l’hydrolyse de l’ATP pour catalyser la séparation des duplexes d’ADN énergétiquement stables. • On trouve les hélicases chez les procaryotes comme chez les eucaryotes, incluant les virus et les bactériophages. • Ces enzymes rompent les liaisons hydrogène entre les deux brins de l’hélice et se déplacent selon une seule direction sur le brin auquel elles sont liées. • Toutes les hélicases sont aussi des translocases et des ATPases ADN-dépendantes.

4. Les hélicasessontessentiellesà la vie cellulaireet contribuent à la stabilitégénomique

5. humain E. coli Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ • Since the discovery of the first DNA helicase in Escherichia coli in 1976, and the first eukaryotic one in the lily in 1978, a large number of these enzymes have been isolated from both prokaryotic and eukaryotic systems, and the number is still growing. • Most contain conserved helicase motifs that act as an engine to power DNA unwinding. • All DNA helicases share some common properties, including nucleic acid binding, NTP binding and hydrolysis, and unwinding of duplex DNA in the 3' to 5' or 5' to 3' direction. ADN-Hélicases répertoriées

6. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ RecQ Family • Les hélicases de la famille RecQ sont hautement conservées de la bactérie à l’homme et sont requises dans le maintien de l’intégrité du génome. • Elle sont impliquées dans diverses troubles génétiques humains. • On a répertorié 5 hélicases de la famille RecQ chez l’homme : • RECQL, WRN, BLM, RECQL4, et RECQL5. • Les hélicases de la famille RecQ ont été ainsi désignées d’après leur homologies avec l’hélicases de E. coli et partagent des voies de recombinaison similaires. • Toutes hélicases RecQ ont des domaines conservés.

7. Syndrome de Werner - vieillissement prématuré Syndrome de Rothmund-Thompson Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Des mutations apparaissant dans WRN et RECQ4 sont à l’origine, respectivement, des syndromes de Werner et de Rothmund-Thomson. Ces 2 maladies, tout comme le syndrome de Bloom, augmentent la prédisposition individuelle au cancer. Chaque maladie est caractérisée par une instabilité génétique, un cancer, et : Syndrome de Bloom Hair loss/graying - Cataracts - Subcutaneous fat loss - Osteoporosis - Arteriosclerosis - Diabetes mellitus Sparse hair - Poikiloderma - Short stature - Cataracts - Skeletal defects Short stature - Immunodeficiency – Photosensitivity - Diabetes mellitus - Male sterility

8. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Possibles rôles de WRN dans la cellule Clearing the path for DNA replication G-rich regions at telomere, rDNA clusters and d(CGG)n repeats. WRN WRN WRN WRN unravels G4 DNA G4 DNA impede fork movement Replication goes on

9. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ La protéine du Syndrome de Werner impliquée dans le métabolisme du télomère

10. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ La technique de la molécule unique révèle les propriétés spécifiques des hélicases de la famille RecQ • L’hélicase RecQ fonctionne en tant que monomère • Exemple de moteur moléculaire • Propriétés de fixation de l’ADN • Parcours de l’ADN avec changement de direction

11. Des expertises complémentaires Biologie Moléculaire Biochimie Enzymologie Bioinformatique Radiocristallographie Physique - Molécule unique Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Vue d’ensemble • Un thématique de recherche axé sur l’étude des relations structure-fonction • d’enzymes impliquées dans la régulation du génome et certains cancers

12. Structure 3D RecQ E. Coli Une enzyme multifonctionnelle Liaison à l’ADN ATPase Hélicase - désappariement - association dble brin Bernstein, D. A., Zittel, M. C., and Keck, J. L. (2003) EMBO J.22, 4910-4921 Fonction très conservée dans l'évolution Domaine hélicase Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ

13. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Fonction très conservée dans l'évolution

14. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Une Enzyme conservée à travers l’évolution 36 % identité ; 52 % similitudes (Alignement des séquences humaine (WRN) et bactérienne (E. coli) réalisé avec CLUSTALW)

15. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Modélisation moléculaire de la protéine du Syndrome de Bloom 4 domaines bioinformatique structurale • Modélisation par homologie (MODELLER) • Information structurale d'origine : RecQ E. coli • Alignement de séquences : CLUSTALW Guo, R.B., Rigolet, P., Zargarian, L., Fermandjian, S. and Xi, X.G. (2005). Nucleic Acids Res.33, 3109-24.

16. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Etude de mutants : le doigt de zinc contrôle toutes les fonctions de l’enzyme BLM E. coli Liu, J.L., Rigolet, P., Dou, S.X.,Wang, P.Y. and Xi, X.G. (2004). J Biol Chem.279; 42794-802. Guo, R.B., Rigolet, P., Zargarian, L., Fermandjian, S. and Xi, X.G. (2005). Nucleic Acids Res.33, 3109-24.

17. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Mesure de l'activité de séparation des double brins d'ADN 32P (B)

18. C-terminal extension Isoforms Helicase activity Zn Finger Helicase core No RecQ5α 410 aa 991aa yes RecQ5β No RecQ5γ 435 aa Not determined dRecQ5a 1057 aa dRecQ5b 470 aa yes Not determined dRecQ5c 468 aa Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Isoformes et domaines du doigt de zinc

19. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Mutations répertoriés

20. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Etude in vitro et in vivo de mutations associées à des cancer • Etude in vitro et in vivodes conséquences structurales et fonctionnelles de mutations observées chez des malades atteints du Syndrome de Bloom • Mutagenèse dirigée • Enregistrement systématique des données Banque de données

21. Relations structure-fonction des hélicases de la famille de RecQ Etude structurale des hélicases BLM, WRN et RECQL5 • Bases moléculaires du fonctionnement de l’enzyme • sites de fixation à l’ADN • domaines impliqués • modélisation des mouvements du moteur moléculaire Enzymes seules complexées à l’ADN Essais de différents ligands de petite taille (inférieure à 20 pdb) simple brin double brin hétéroduplex • Nouveau protocole de purification • construction sans HIS-Tag • Nouvelle technique de cristallisation : microfluidique • méthode semi automatique • économie de matériel biologique • très grand nombre d’essais

22. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Autres projets • Relations avec le télomère • S3D enzyme complexé à un motif du télomère • Spécificité vis-à-vis de certains substrats • Effet des métaux autre que zinc • Etude de RIG I, un autre membre la famille RecQ [leucémie aiguë]

23. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Cancer et vieillissement prématuré Xu Guang Xi [CR1] Pascal Rigolet [MCF] Sophia Guo [Doctorante] Collaborations • O. MAUFFRET et S. FERMANDJIAN • Structure des Acides Nucléiques et Peptides (Institut G. ROUSSY) • Etude en solution du doigt de zinc de BLM en complexe avec l'ADN • V. CROQUETTE et D. BENSIMON • Laboratoire de physique statistique – département de biologie (ENS PARIS) • Etude des propriétés de RecQ par la technique de molécule unique • Thierry BIZEBARD • LBPC – Paris • Chen YONG • Laboratoire de microfluidique – département de chimie (ENS PARIS)

24. COLLABORATIONS et FINANCEMENT F. Müller Roche Suisse VA. Bohr NIH USA G. Zocchi California USA M.Amor-Gueret Institut Curie Orsay JC. Brochon E. deprez Fluorescence R.Pansu ENS V. Croquette D. Bension Paris Z. Chen Shanghai Chine M. Le Bret Dynamique P. Tauc Imagerie IFR d’Alembert Biologie-Physique-Chimie Programme PCV CNRS Ligue contre le cancer