第五章环境化学物的特殊毒性及其评价

第五章环境化学物的特殊毒性及其评价 第一节环境化学物的致突变性及其评价

一、引言 物种的各个体和各代之间的种种变化称为变异。可遗传变异即称为突变（mutation）。有自发的和诱发的。相当多的外来化学物能直接损伤DNA或产生其他遗传学改变而使基因和染色体发生改变——遗传毒物或致突变物或诱变剂。二、遗传损伤的类型可分为三类：基因突变、染色体突变和基因组突变

（一）基因突变 指在基因序列中DNA序列的改变，也叫点突变。 1、碱基置换碱基置换指DNA序列上的某个碱基被其他碱基取代。首先在DNA复制时会使互补链的相应位点配上一个错误的碱基，即发生错误配对。这一错误配上的碱基在下一次DNA复制时却能按正常规律配对，于是一对错误的碱基置换了原来的碱基对，亦即最终产生碱基对置换或简称碱基置换。转换（transition）：嘌呤与嘌呤碱基之间的置换，或嘧啶与嘧啶之间的置换颠换（transversion）：嘌呤与嘧啶碱基之间的置换。

2、移码 移码是DNA中增加或减少了一对或几对不等于3的倍数的碱基对所造成的突变。

3、整码突变 指在DNA中增加或减少的碱基对为一个或几个密码子。 4、片断突变指基因中某些小片断核苷酸序列发生改变。这种损伤有时可跨越两个或数个基因。片断突变包括缺失、重复、重组、重排。

（二）染色体突变 也称染色体畸变，是染色体或染色体单体受损而发生断裂，且断端不发生重接或虽重接却不在原处。能使染色体或染色单体发生断裂的物质称为断裂剂，这种作用的发生及其过程称为断裂作用。断裂作用的关键是诱发DNA链断裂。

（1）裂隙（gap） 在染色体上出现无染色质的区域，但该区域两端的染色体仍保持线状连接者为裂隙。一般认为裂隙属于非染色质损伤。裂隙不计入畸变范围。（2）断裂（break）指染色体上狭窄的非染色带,无线状连接者为断裂.带宽超过染色单体宽度.

（3）断片（fragment）、缺失（deletion） 一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，并且这些已断裂的节段远远分开，常将无着丝粒断片简称为断片。有着丝粒的部分称为缺失，缺失有末端缺失和中间缺失。

（4）微小体（minute body） 中间缺失如断片很小，小于染色单体宽度，呈圆点状，称为微小体。（5）无着丝粒环（acentric ring）一条较长的无着丝粒断片的两端连接，就形成无着丝粒环。

（6）环状染色体（ring chromosome） 染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒的节段的两断端连接形成一个环时，称为环状染色体。（7）双着丝粒染色体（dicentric chromosome）两条染色体断裂后，两个有着丝粒的节段重接形成。

（8）倒位（inversion） 当某一染色体发生两次断裂后，其中间节段倒转180再重接，称为倒位。臂间倒位：颠倒的是具有中间着丝粒的中间节段臂内倒位：颠倒的是长臂或短臂内的一段

（9）易位（translocation） 两个非同源染色体断裂后，从某个染色体断下的节段接到另一染色体上称为易位。两条染色体同时断裂，相互交换断片并重接——相互易位仅一个染色体节段连接到另一染色体上——单方易位；三个或三个以上染色体断裂、重接——复杂易位

（10）插入（insertion）和重复（duplication） 当一个染色体发生三处断裂，带有两断端的断片插入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接起来，称为插入。如此时有缺失的染色体和有插入的染色体是同源染色体，且分别有一处断裂发生于同一位点，则插入将使该染色体连续出现两段完全相同的节段，此时称为重复。

（11）辐射体 染色体间的不平衡易位可形成三条臂构型或四条臂构型，分别称为三辐射体和四辐射体。在多个染色体间的单体互换可形成复合射体。

（三）基因组突变 指基因组中染色体数目的改变，也称染色体数目畸变。包括非整倍体和整倍体。

1、非整倍体 指比二倍体多或少一条或多条染色体。缺体是指缺少一对同源染色体， 2n-2 单体指某一对同源染色体相应地少一个， 2n-1（X单体）三体指某一对同源染色体相应地多一个，2n+1（21三体）四体则指其比同源染色体多一对， 2n+2 2、整倍体指染色体数目的异常是以染色体组为单位的增减，如三倍体、四倍体。

三、致突变作用机理 外源化学物引起基因突变和染色体突变的靶部位主要是DNA，而导致染色体数目异常的靶部位主要是有丝分裂和减数分裂器，如纺锤丝。（一）DNA损伤和突变 1、碱基类似物的取代有些化学物的结构与碱基非常相似，称碱基类似物。它们能在S期中可与天然碱基竞争，并取代其位置。

2、与DNA分子共价结合形成加合物 许多亲电子性化学物可与DNA作用形成加合物（adduction）。不同诱变剂与DNA作用的碱基位置不同，可引起不同类型的突变。烷化剂可提供甲基或乙基等烷基，与DNA发生共价结合。对DNA和蛋白质都有强烈烷化作用。各类烷化剂烷化活性有别，一般情况下甲基化＞乙基化＞高碳烷基化。

3、改变或破坏碱基的化学结构 对碱基的氧化作用——结构破坏或改变或链断裂——碱基置换。例如，亚硝酸根能使腺嘌呤和胞嘧啶发生氧化性脱氨，相应变为次黄嘌呤和尿嘧啶。 4、大分子嵌入DNA链如吖啶类染料（吖啶橙），是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤-嘧啶对十分相似，能嵌入两个相邻的DNA碱基对之间，造成移码突变。

(二)非整倍体及整倍体的诱发 非整倍体畸变的原因：（1）不分离：同源染色体在第一次减数分裂中不分离；姐妹染色体在第二次减数分裂或有丝分裂中不分离（2）染色体丢失由于纺锤体形成不完全或着丝粒受损使得染色体在分离过程中没有进入任一个子细胞核中。

整倍体诱发的原因 1、有丝分裂染色体组不分离 2、减数分裂异常，形成二倍体配子 3、卵子被多个精子受精

（三）DNA损伤的修复和突变 1、生物体DNA损失修复系统（1）复制前的修复过程——精确修复，包括直接修复和切除修复 a、直接修复：包括光修复和O6－甲基鸟嘌呤修复光修复：修复的过程是通过在波长范围为320～370mm（兰光）的可见光中，二聚体可直接恢复成原来的样子。催化光复活反应的酶叫做光裂合酶

O6-甲基鸟嘌呤修复：修复在O6位上含有烷基的鸟嘌呤，靠O6-甲基鸟漂吟-DNA-甲基转移酶将O6-甲基鸟嘌呤的甲基转移至该酶的半胱氨酸残基上，而恢复鸟嘌呤正常的碱基配对特性，该酶在修复过程中被不可逆地失活。O6-甲基鸟嘌呤修复：修复在O6位上含有烷基的鸟嘌呤，靠O6-甲基鸟漂吟-DNA-甲基转移酶将O6-甲基鸟嘌呤的甲基转移至该酶的半胱氨酸残基上，而恢复鸟嘌呤正常的碱基配对特性，该酶在修复过程中被不可逆地失活。

b、切除修复(excixion-repair) 由于这过程并不依赖于光的存在故又称为暗修复（dark repair）。包括核苷酸切除修复（大段异常核苷酸）；碱基切除修复（个别异常碱基）；错配碱基修复核苷酸切除修复(nucleotide excision repair)是所有生物体内最常见的修复机制。它可修复几乎所有的DNA损伤类型，包括其他修复机制不能修复的加合物及DNA链间交联等。

碱基切除修复： A：六边型表示错误的碱基 B：DNA糖基化酶切除错误的碱基 C：AP内切核酸酶及AP裂解酶切除磷酸二酯链及糖基 D：DNA聚合酶填补单一核苷酸。 E：DNA连接酶封闭缺口错配碱基修复(mismatch base repair)是一种特殊的切除修复形式，通过该机制可去除不正确的碱基配对，如G：T和A：C。

（2）复制后修复 这个系统是在DNA复制时模板链上含有损伤的碱基导致子链产生裂缺，这是在复制时产生的，所此修复系统也属于复制后修复。复制时新合成的互补链相应部位出现空隙，随后以重组作用及链延长作用填补。通过此机制，使DNA合成得以通过损伤部位，避免了致死性的后果，但存在的DNA损伤并末移除，仍有待通过其他的修复机制而修复。

（3）SOS修复——易误修复 是DNA受到严重损伤，细胞处于应急状态时所诱导的一种DNA修复方式，结果是只能维持基因组的完整性，提高细胞生存率，但留下错误较多。SOS修复必须在损伤因素的诱导下发生，容易出现修复错误。主要在复制时起作用。

2. DNA损伤修复与突变 突变的产生不仅与DNA受损的情况有关，DNA损伤修复也是决定突变发生与否的重要因素。DNA损伤修复功能的缺失或修复能力降低都会使突变的发生明显增加。 ● 切除修复缺陷的人二倍体成纤维细胞 ○ 正常的人二倍体成纤维细胞

照射时间(min) 突变频率(×10－4) 末诱导SOS功能宿主菌诱导SOS功能宿主菌 0 1.8 13.8 60 9.6 65.0 180 13.2 100.2 突变的发生还与DNA损伤修复的正确性密切相关。太阳光照射诱发M13mp2噬茵体基因突变在不同宿主中的表达

四、突变的不良后果 突变的靶细胞有体细胞和生殖细胞（一）体细胞突变的后果 1、癌变 2、畸变：胚胎体细胞突变，造成畸胎 3、其他不良后果：动脉粥样硬化、衰老。（二）生殖细胞突变的后果 1、致死性 2、可遗传的改变：显性遗传病、隐性遗传病

五、致突变作用的评价 （一）致突变试验的分类目前有200多种，重要的和常规使用的大约20多种。依据检测的遗传学终点的不同，可分为四类：基因突变试验、染色体损伤试验、非整倍体试验和其他反映DNA损伤的试验。 1、细菌回复突变试验细菌回复突变试验是以营养缺陷的突变体菌株为试验系统，观察受试物引起其回复突变的作用。大肠杆菌——大肠杆菌回复试验鼠伤寒沙门氏菌——Ames实验

原理： Ames试验，检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力。试验菌株都有组氨酸突变(his-)，不能自行合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长，回复突变成野生型后能自行合成组氨酸，可在最低营养平皿上生长成可见菌落。计数最低营养平皿上的回变菌落数来判定受试物是否有致突变性。

2. 哺乳动物细胞基因突变试验(mammalian cell gene mutation assay) 哺乳动物细胞基因突变试验是利用啮齿类和人体外培养细胞的基因正向突变试验。常用细胞株选用的基因座小鼠淋巴瘤细胞L5178Y TK、HPRT 中国仓鼠卵巢组织细胞CHO HPRT 中国仓鼠肺组织细胞V79 HPRT 人淋巴细胞 HPRT

（1）TK基因座 TK：胸苷激酶，催化胸腺嘧啶脱氧核苷＋ATP →胸苷酸。存在嘧啶类似物5－溴脱氧尿苷时，产生异常核苷酸使细胞死亡。受试物存在时若细胞不死亡说明TK发生突变。（2）HPRT基因座次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶：催化次黄嘌呤＋鸟嘌呤＋磷酸核糖焦磷酸→核苷-5’-单磷酸（NMP），补充途径。如存在碱基类似物，生成相应的NMP，掺入到DNA中可致死。加入受试物后能存活的细胞表示发生基因突变——HPRT-

3、染色体畸变试验 制备细胞分裂中期相染色体标本，在光镜下可直接观察染色体的数目和形态的改变。染色体畸变试验也常称为细胞遗传学试验(cytogenetic assay)。染色体畸变试验可为体外试验，也可为体内试验，包括对体细胞和生殖细胞的分析。结构畸变：可观察到裂隙、断裂、断片、微小体、环状染色体、双或多着丝粒染色体和射体。数目畸变：需在染毒后经过一次有丝分裂才能发现。但是经过一次有丝分裂后，一些结构畸变可能因遗传物质的丢失而致细胞死亡，因此不能发现。所以应安排多次收获时间，以便分别检查断裂剂的作用。

体内试验：多观察骨髓细胞，其分裂旺盛、易于获得和制备，优势在于可体现哺乳动物的代谢过程、DNA修复和药物动力学特征。但应注意受试物或其活性代谢产物有可能不易在骨髓中达到足够的浓度。体内试验：多观察骨髓细胞，其分裂旺盛、易于获得和制备，优势在于可体现哺乳动物的代谢过程、DNA修复和药物动力学特征。但应注意受试物或其活性代谢产物有可能不易在骨髓中达到足够的浓度。体外试验：常用中国仓鼠肺细胞(CHL)，以及中国仓鼠卵细胞(CHO)和V79等细胞系，但任何细胞系的染色体皆不稳定，不能准确地观察非整倍体，故在体外试验中，如考虑进行染色体数目观察，应当使用原代或早代细胞

4、微核试验 微核是染色体的断片或迟滞的染色体在细胞分裂后期，由于不能进入子细胞的核中而在间期的子细胞胞浆内形成的游离团块物质，它与细胞主核着色一致，圆形或椭圆形。

常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)或外周血细胞进行微核试验。PCE是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，微核容易辩认，PCE胞质含RNA染色与成熟红细胞易于区别，故为骨髓微核试验的首选细胞群。一般采用多次染毒后24h采样。常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)或外周血细胞进行微核试验。PCE是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，微核容易辩认，PCE胞质含RNA染色与成熟红细胞易于区别，故为骨髓微核试验的首选细胞群。一般采用多次染毒后24h采样。

5. 显性致死试验(dominant lethal assay) 显性致死(dominant lethal)指发育中的精子或卵子细胞发生遗传学损伤，导致受精卵或发育中的胚胎死亡。一般认为显性致死主要是由于染色体损伤的结果。显性致死试验以胚胎死亡为观察终点，用于检测受试物对动物性细胞的染色体损伤作用。一般采用性成熟的雄性大鼠或小鼠接触受试物，然后使之与未染毒的雌性交配，观察胚胎死亡情况。计算出受孕率、总着床数、早期和晚期胚胎死亡率予以评价。

6、小鼠精子畸形试验 精子畸形指精子形态发生异常改变。可导致生育能力的改变。用于检测外源化学物对精子生成和发育的影响，也可用于评价化学物对生殖细胞的致突变作用。常用6－8周的小鼠，连续5天染毒。在染毒后不同时间（1、4、10周）处死，取样检查镜子形态。

7、程序外DNA合成试验(unscheduled DNA synthesis test，UDS) 正常细胞在有丝分裂过程中，仅在S期进行DNA复制合成。当DNA受损后，DNA的修复合成可发生在正常复制合成期(S期)以外的其他时期，称为程序外DNA合成。用同步培养将细胞阻断于Gl期，并将正常的DNA半保留复制阻断，然后用受试物处理细胞，并在加有3H-胸腺嘧啶核苷的培养液中进行培养。利用放射自显影法或液闪计数法测定掺入DNA的放射活性，检测DNA修复合成，从而间接反映DNA的损伤程度。

8、转基因动物致突变试验 近年来建立的转基因动物致突变检测模型为研究哺乳动物体内基因突变提供了有效的手段，可以在动物个体水平研究突变的器官、组织特异性，包括生殖细胞。并可比较容易地从动物基因组中重新回收导入的基因，进行序列分析。转基因动物指基因组中整合有用实验方法导入的DNA(可以是完整的基因，也可是不完整的DNA片段)，并能遗传给后代的一类动物。在进行转基因动物致突变试验时，在染毒后先抽提不同器官或组织的基因组DNA，然后把纯化的基因组DNA与噬菌体体外包装抽提物混合，而将导入的基因载体包装进噬菌体中，用这些噬菌体感染大肠菌，可形成噬菌斑，通过噬菌斑颜色变化进行突变的判断并获得突变子。

（三）致突变试验在预测致癌性及遗传危害性中的价值（三）致突变试验在预测致癌性及遗传危害性中的价值致突变试验的主要目的是研究外源化学物引起人类生殖细胞的突变并传递给后代的可能性；另外基于体细胞突变与肿瘤有关的认识，也可用于外源化学物潜在致癌性的预测。虽然致突变试验可用于外源化学物致癌性的筛选，但也存在不足。在致癌性预测时致突变试验适用于遗传毒性致癌物和非遗传毒性非致癌物。对于遗传毒性非致癌物会出现假阳性，对于非遗传毒性致癌物则会出现假阴性。

预测遗传学危害也即预测对哺乳动物性细胞的致突变性。哺乳动物性细胞致突变物的标准体内试验需较大的动物数量，且费时、费钱，不可能广泛使用。可利用短期致突变试验对哺乳动物性细胞致突变性及遗传危害性进行预测。预测遗传学危害也即预测对哺乳动物性细胞的致突变性。哺乳动物性细胞致突变物的标准体内试验需较大的动物数量，且费时、费钱，不可能广泛使用。可利用短期致突变试验对哺乳动物性细胞致突变性及遗传危害性进行预测。生殖细胞的致突变试验在预测遗传危害性中具有重要的意义。但一般认为，体细胞致突变试验阴性的化学物，在生殖细胞试验中一般也为阴性。所以，一般都是先进行体细胞的诱变性检测，发现部分试验结果阳性或有生殖细胞接触证据时，再进行生殖细胞的诱变性检测。

哺乳动物性细胞致突变性与对人的遗传危害性之间还缺乏直接相关的证据。为评价外源化学物对人类的遗传危害性，遗传流行病学研究是最直接、最可靠的方法，但难度很大。哺乳动物性细胞致突变性与对人的遗传危害性之间还缺乏直接相关的证据。为评价外源化学物对人类的遗传危害性，遗传流行病学研究是最直接、最可靠的方法，但难度很大。目前，评价遗传危害主要还是依据致突变试验的结果，特别是体内生殖细胞的致突变试验结果。如果一种化学物在多项致突变试验中证明有致突变性，一般也假定其对人也可能具有遗传危害性。

第二节环境化学物的致癌作用及其评价

一、环境致癌与化学致癌 癌症的发生80－90％由环境因素引起，包括物理因素、生物因素和化学因素。其中主要是化学因素。在环境因素引起的肿瘤中，80％以上由化学因素引起。化学致癌(chemical carcinogenesis)是指化学物质引起正常细胞发生恶性转化并发展成肿瘤的过程，具有这种作用的化学物质称为化学致癌物(chemical carcinogen)。在此，“癌”的含义包括上皮的恶性变(癌)，也包括间质的恶性变(肉瘤)及良性肿瘤。

第五章 环境化学物的特殊毒性及其评价