免疫实验理论讲授

1. 免疫实验理论讲授 周艳 王飞 julysec@jlu.edu.cn fei@jlu.edu.cn www.themegallery.com

2. 主要内容 • 示范教学 • 血清学反应 • 单克隆抗体技术 • 本学期实验 • 多克隆抗体的制备 • T淋巴细胞转化试验 • NK细胞毒活性的检测 www.themegallery.com

3. 血清学反应 www.themegallery.com

4. 血清学反应 抗原(antigen)是一类能刺激机体免疫系统产生抗体和/或致敏淋巴细胞，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内外发生特异性结合而出现反应的物质。 抗体（antibody）指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。 血清学反应：是体外发生的抗原抗体反应，根据可见的现象判定反应结果。 微生物鉴定 传染病及寄生虫病诊断检测 www.themegallery.com

5. 血清学反应 二、血清学试验的特点 （一）特异性和交叉性 （二）敏感性 （三）可逆性 （四）反应的二阶段性 （五）最适比例与带现象 （六）用已知测未知 www.themegallery.com

6. 血清学反应 三、影响血清学试验的因素 （一）电解质 （二）温度 （三）酸碱度 （四）振荡 （五）杂质和异物 www.themegallery.com

7. 血清学反应 三、血清学反应类型 （一）凝集反应 （二）沉淀反应 （三）补体结合反应 （四）中和反应 （五）免疫酶标技术 www.themegallery.com

8. 血清学反应 凝集反应 细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在红细胞、乳胶等颗粒性载体表面的可溶性抗原，与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，经过一定时间，复合物互相凝聚形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验（Agglutination test）。参与凝集试验的抗原称凝集原，抗体称凝集素。参与凝集试验的抗体主要为IgG和IgM。凝集试验可用于检测抗体或抗原， 最突出的优点是操作简便，便于基层的诊断工作。 www.themegallery.com

9. 血清学反应 凝集反应的类型 1、直接凝集反应 颗粒性抗原与相应抗体直接结合并出现凝集现象的试验称直接凝集试验。 （1）玻片法 （沙门氏菌、链球菌、血型鉴定） （2）试管法（布氏杆菌病诊断） 2、间接凝集反应 将可溶性抗原(或抗体)先吸附于一种与免疫无关、一定大小的不溶性颗粒的表面，然后与相应的抗体(或抗原)作用，在有电解质存在的适宜条件下，所发生的特异性凝集反应，称为间接凝集试验 （1）正向间接凝集反应 （2）反向间接凝集反应 （3）间接凝集抑制反应 www.themegallery.com

10. 血清学反应 （1）玻片法 定性试验，在玻璃板或瓷片上进行。将含有已知抗体的诊断血清与待检悬液各一滴在玻板上混合，数分钟后，如出现颗粒状或絮状凝集，即为阳性反应。用已知抗体检测未知抗原。 新分离的细菌的鉴定、血型鉴定等。 待测红细胞悬液 抗B 抗A www.themegallery.com

11. 血清学反应 （2）试管法 定量试验，在试管中进行，用以检测待检血清中是否存在相应抗体和检测该抗体的效价（滴度），应用于临床诊断或流行病学调查。用已知抗原检测未知抗体。 已知抗原 待测血清倍比稀释 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 C www.themegallery.com

12. 血清学反应 www.themegallery.com

13. 血清学反应 沉淀反应 可溶性抗原(如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等)与相应的抗体结合，在适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验（Precipitation reaction test）。参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称沉淀素。 可溶性Ag＋ 相应Ab肉眼可见沉淀物 电解质 比例适当 www.themegallery.com

14. 血清学反应 沉淀反应的分类 沉 淀 反 应 环状沉淀反应 絮状反应 单扩散 对流免疫电泳 琼脂扩散 + 电泳 双扩散 火箭电泳 www.themegallery.com

15. 血清学反应 单扩散沉淀 即将定量的抗体混合于琼脂中，待琼脂凝固后打孔加入抗原，孔中的抗原向四周扩散，在抗原与抗体的比例合适处呈现白色的沉淀环。沉淀环的大小与抗原的浓度成正比，故该试验是定量试验。 应用:广泛应用于兽医临床，如鸡马立克氏病诊断。缺点需要经1～2天结果。 www.themegallery.com

16. 血清学反应 双扩散沉淀 即将抗原和抗体分别加入琼脂对应的孔中，二者会向四周扩散，在二者比例合适处形成白色沉淀线。 应用:检测 AFP HBsAg, 协助疾病诊断. www.themegallery.com

17. 血清学反应 • 定义：即带电颗粒在电场的作用下向着相反的电极移动，称为电泳。 • 原理：大部分抗原在碱性溶液（pH>8.2）中带负电荷，在电场中向正极移动；而抗体球蛋白带电荷弱，在琼脂电泳时，由于电渗作用，向相反的负极移动。 www.themegallery.com

18. 血清学反应 对流免疫电泳的原理 • 蛋白质抗原在碱性环境中，其羧基发生电离而带负电荷，在电泳时从负极向正极移动。 • 抗体分子在电场中从正极向负极移动。 www.themegallery.com

19. 血清学反应 火箭免疫电泳 • 单向扩散+电泳：将单向扩散与电泳技术相结合的一种方法。 • 沉淀峰的高度与抗原的浓度成正比。 抗原定量检测 www.themegallery.com

20. 单克隆抗体技术 www.themegallery.com

21. 单克隆抗体技术 多克隆抗体 由于抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体，这些由不同B细胞克隆产生的抗体称之为多克隆抗体。 传统的方法制备的抗体是用抗原免疫动物后所得。 www.themegallery.com

22. 单克隆抗体技术 单克隆抗体：抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 www.themegallery.com

23. 单克隆抗体技术 杂交瘤技术 • 单一的B细胞克隆具有相同的性状 • B细胞能分泌特异性抗体，不能长期培养 • 骨髓瘤细胞不能分泌抗体，能长期培养 • 二者的融合细胞形成杂交瘤细胞，既能分泌特异性抗体，又能连续传代培养 www.themegallery.com

24. 单克隆抗体技术 • 杂交瘤技术原理： • 聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 • HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤细胞系 • 单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体 www.themegallery.com

25. 单克隆抗体技术 杂交瘤细胞培养的关键 • HAT培养基： • H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 • A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 • T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA • HAT选择作用： • 淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断 • 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase）缺乏，DNA合成的替代途径受阻 www.themegallery.com

26. 单克隆抗体技术 • 杂交瘤细胞筛选： • 杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。 • 常用的抗体检测方法： • （1）免疫酶技 • （2）免疫荧光技术 • （3）间接血凝试验 • （4）放射免疫测定 www.themegallery.com

27. 单克隆抗体技术 阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存 有限稀释法(limiting dilution) 显微操作法(micromanipulation) FACS法（fluorescence activated cell sorter） 软琼脂平板法(soft agar method) www.themegallery.com

28. 主要内容 • 示范教学 • 血清学反应 • 单克隆抗体技术 • 本学期实验 • 多克隆抗体的制备 • T淋巴细胞转化试验 • NK细胞毒活性的检测 www.themegallery.com

29. 多克隆抗体的制备 由于抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体，这些由不同B细胞克隆产生的抗体称之为多克隆抗体。 传统的方法制备的抗体是用抗原免疫动物后所得。 www.themegallery.com

30. 多克隆抗体的制备 免疫动物的选择 供免疫用的动物主要有哺乳粪和禽类．其中常用的有家兔、绵羊、豚鼠和鸡，有时根据需要也可选用鼠，山羊和马等。选择动物时应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体的选择等因素。如甾体激素多用家兔；对于难以获得的抗原，且抗体需要量少，可用纯系小鼠制备。 www.themegallery.com

31. 多克隆抗体的制备 佐剂（adjuvant ）一类非特异性免疫增强剂，先于抗原或与抗原一起注入机体，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。 佐剂种类 a. 油性乳剂 — 弗氏佐剂（Freund adjuvant） b. 无机化合物 c. 微生物及其产物 d. 脂质体 e.免疫刺激复合物（ISCOM） f. 细胞因子 www.themegallery.com

32. 用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、poly I∶C、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋白 常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂(Freund’s adjuvant) 弗氏佐剂(Freund,s adjuvant)： 弗氏完全佐剂－羊毛脂与液体石蜡的混合物 弗氏不完全佐剂－弗氏完全佐剂加卡介苗 www.themegallery.com

33. 实验器材及物品 试剂: 抗原：OVA（卵清蛋白） 抗体： 一级抗体：小鼠血清 二级抗体：HRP-Ab 封闭液：5% 脱脂奶粉 包被缓冲液 抗体稀释液：PBS 　 洗液：PBST 底物溶液：OPD 终止液：2M 硫酸 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 器材: 96孔板 加样器(一套） 加样器头（一套） 吸水纸（若干） 酶标仪（一台） 1.5mlEP管：20个/组 4mlEP管：2个/组 www.themegallery.com

34. 主要操作步骤 一、免疫小鼠 二、制备血清 三、用Elisa法检测血清中抗体的效价 www.themegallery.com

35. 免疫小鼠 • 免疫方式 • 肌肉注射（intramuscular injection ，i.m.） • 腹腔注射（intraperitoneal injection，i.p. ） • 皮下注射（subcutaneous injection，s.c.） • 静脉注射（intravenous injection ，i.v.） • 抗原：OVA 7天免疫一次，共三次 • 免疫佐剂 • 弗氏佐剂(Immunoadjuvant ) • 不完全弗氏佐剂（石蜡油+羊毛脂） www.themegallery.com

36. 制备血清 • 摘取小鼠眼球，用1.5ml EP管接血。 • 拉颈处死小鼠。 • 4000rpm，离心10分钟，吸取上清（血清）待用。 www.themegallery.com

37. 免疫小鼠血清抗体效价测定 • 酶联免疫吸附（ enzyme-linked immunosorbent assay ， Elisa ） • 利用抗原抗体反应的高度特异性和酶对底物高效催化性，将抗原或抗体吸附于固相载体表面，通过底物的显色反应鉴定抗原抗体结合的反应 • ELISA是目前应用最广泛的免疫学检测技术之一，常用来测量机体的可溶性的抗原或抗体。 • 由于它敏感性高，可测微量的的抗体或激素、细胞因子及粘附分子等抗原性物质。 www.themegallery.com

38. 酶联免疫吸附的基本原理 利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。 www.themegallery.com

39. www.themegallery.com

40. 酶结合物 酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产物。具有酶促反应，显示出生物放大作用。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。 www.themegallery.com

41. 酶的底物 1、HRP催化过氧化物的氧化反应。 供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB) OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适吸收波长为492nm TMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为405nm 2、AP为磷酸酯酶 一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应 www.themegallery.com

42. 实验步骤 包 被:OVA抗原(50ug/ml) 100µL/孔, 4 ℃过夜. 封 闭：弃上清, 加入封闭液 150 µL/孔, 37℃，40min. 洗 涤:弃上清，加洗液200ul/孔，洗涤三次, 每次3分钟. 一 抗:弃上清, 加入不同稀释度的待测血清抗体100 µL/孔　37℃ ，40min. 洗 涤:弃上清，加洗液200ul/孔，3分钟,弃上清，再重复两次 酶标抗体:弃上清,加入HRP标二抗100 µL/孔37℃ 40min. 洗 涤:弃上清，洗涤三次, 每次3分钟 显 色:弃上清，加入底物100 µL/孔，避光10min 加终止液:加2M硫酸 50 µL/孔 测 量:酶标仪测定OD 490nm值. www.themegallery.com

43. 抗体的倍比稀释 500µL 500µL 500µL 500µL 500µL 500µL 5µL 抗体(血清) 500µL 抗体稀释液 (PBS) 995µL 抗体稀释液（PBS） 1 2 3 4 5 6 7 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 加佐剂组（+）和不加佐剂组（—）血清各做一套上述稀释度 www.themegallery.com

44. 加板方法 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 加佐剂组 A B C D E F G H 不加佐剂组 每组一块96孔板，每个样三个复孔，纵向排列。加样如下： 1- 7: 不同稀释度的抗体，依次为1/200，1/400，1/800，1/1600，1/3200，1/6400，　1/12800； 8：阴性对照孔。 www.themegallery.com

45. 结果判定 • 抗体效价: 1. 出现颜色变化的抗体最高稀释倍数 （目测） 2. 二倍于阴性对照OD值(酶标仪） www.themegallery.com

46. 结果分析 • 观察实验现象：从加底物到终止反映是的颜色 变化，及各个稀释度之间的颜色差异。 • 判定出加佐剂组和不加佐剂组的抗体效价（二倍于阴性对照OD值）。 • 用Excel处理数据，作图，横坐标为抗体的稀释度，纵坐标为OD490的数值。 • 将用Excel图表和原始数据（每人一份）贴到实验记录本上。 www.themegallery.com

47. Excel作图 www.themegallery.com

48. 主要内容 • 示范教学 • 血清学反应 • 单克隆抗体技术 • 本学期实验 • 多克隆抗体的制备 • T淋巴细胞转化试验 • NK细胞毒活性的检测 www.themegallery.com

49. 实验主要内容 • 实验原理 • 实验分组及材料 • 主要操作步骤 • 检测方法 www.themegallery.com

50. Lymphocytes(B/T) mitogens Proliferation transformation NucleicAcid↑ Protein ↑ Specificity Ag lymphoblast 原理 • 淋巴细胞在体外培养时，受到刺激物的刺激后可表现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。此现象称为淋巴细胞转化现象（简称为淋转）。 • 淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。 www.themegallery.com