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Spingere, tirare o …?

Spingere, tirare o …?. Brute force is no substitute for understanding. Come aumentare/modificare l’amido?. Rilevanza dell’amido * Cibo (wheat, rice, maize & potato) >10 9 t/yr * Additivo in prodotti per consumo umano (farmaci…)

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Spingere, tirare o …?

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Presentation Transcript

  1. Spingere, tirare o …? Brute force is no substitute for understanding Come aumentare/modificare l’amido?

  2. Rilevanza dell’amido * Cibo (wheat, rice, maize & potato) >109 t/yr * Additivo in prodotti per consumo umano (farmaci…) * Usi industriali: (cartaria, tessile, estrattiva …) 7x107 t/yr * Etanolo… E’ amido purificato (separato dal resto) The UK alone consumes approximately 880,000 tonnes of starch annually, 3/4 of which is eaten, while the rest is destined for industry. Starch and its derivatives are already widely employed in the manufacture of paper, textiles and adhesives, and due to their biodegradable and renewable nature they are increasingly being considered as an environmentally-friendly alternative to the use of synthetic additives in other products, including plastics, detergents, pharmaceutical tablets, pesticides, cosmetics, oil-drilling fluids… http://www.andrewgray.com/essays/starch.htm

  3. 17/01/2014 53+22 = 75 M kg 460 M litri Con 1 Kg di granella si fanno 6 l di birra

  4. Starch Technology http://www.zuckerforschung.at/inhalt_en.php?titel=STARCH%20TECHNOLOGY&nav=nstaerkeinfo_en&con=cstaerkinfo_en Very comprehensive website on starch technology, raw materials, properties, uses and extraction. The largest users of starch in the EU (30 %) are the paper, cardboard and corrugating industries. Other important fields of starch application are textiles, cosmetics, pharmaceuticals, construction and paints. In the medium and long run starch will play an increasing role in the field of “renewable raw materials” for the production of biodegradable plastics, packaging material and moulds. Uso dell’amido nell’industria cartaria: Paper industry is one of the largest users of starch. Starch is, in fact, the third most prevalent raw material component in paper, only surpassed by cellulose fiber and mineral filler. Depending on the type of paper produced, starch content in the final products may be as high as 10% by paper weight. Starch used in paper manufacture is generally found in three application areas which are wet end internal sizing, surface sizing and coating. http://www.thaitapiocastarch.org/article17.asp In Germany alone the paper and adhesives industry require 500,000 tonnes of highly purified amylopectin each year. Then there is the textile industry too, which uses the starch to glaze threats prior to weaving. The food industry is also relevant.

  5. http://www.zuckerforschung.at/fenster_en.php?img=images/cist_dia1_g_en.jpghttp://www.zuckerforschung.at/fenster_en.php?img=images/cist_dia1_g_en.jpg ~70 Mt di amido nel 2010; una crescita annua del 4%

  6. Starch is made of about 70% amylopectin and 30% amylose by weight (la proporzione dipende dalla coltura, varietà, stadio…) Amylopectin Amylopectin is not soluble in water.  addensante (aumenta la viscosità) Large and highly branched Branched polymer with linear streches with α(1→4) glycosidic bonds and branches with α(1→6) bonds every 24 to 30 glucose units. Contains 2,000 to 200,000 glucose units

  7. Amylose Linear polymer, 300-3000 units Amylose is soluble in water, assumes a spyral shape in solution  Gelificante Amylose starch is less readily digested than amylopectin (why?)  dal punto di vista nutrizionale diluisce il carico da glucosio ed è interessante per i diabetici Biogenesis of potato starch granules http://www.agfdt.de/loads/st07/visseabb.pdf

  8. www.jic.ac.uk/staff/trevor-wang/appgen/starch/images/starchpath2.jpgwww.jic.ac.uk/staff/trevor-wang/appgen/starch/images/starchpath2.jpg L’industria chiede sostanze arricchite (e.g. solo amilopectina). Purificabili con procedimenti industriali (costosi).  è possibile ottenere amidi modificati per mezzo di mutanti spontanei o transgenici (alterando GBSS, SSI, I & III …). http://www.jic.ac.uk/staff/trevor-wang/appgen/starch/mutatab.html

  9. High Amylose High Amylopectin National Center for Genetic Engineering and Biotechnology Thailand

  10. Varietà con un contenuto di amilosio/amilopectina alterato esistono già per numerosi organismi: Waxy mutants (maize, rice, cassava, broad bean, pea, wheat, barley, potato…, even Chlamydomonas) present little or no amylose. Waxy corn: 100 % amylopectin, normal corn 75 % amylopectin High amylopectin maize mutants All’estremo opposto: Amylomaize: a unique corn starch with high (>50%) amylose. Similar mutants in cassava… http://en.wikipedia.org/wiki/Waxy_corn http://en.wikipedia.org/wiki/Amylomaize

  11. http://www.freshplaza.it/news_detail.asp?id=30541 Introduzione delle patate OGM per uso industriale e nuovi scenari nei materiali ecologici A cura di Rossella GigliE' notizia recente che la BASF, in collaborazione con l'olandese AVEBE, sta lavorando allo sviluppo di patate geneticamente modificate al fine di produrre tuberi con livelli maggiori di amido, soprattutto nella tipologia molecolare dell'amilopectina. Queste patate, come la già autorizzata Amflora, aprono interessanti scenari nel settore degli impieghi non-food della fecola di patate.  ELENCO DEGLI USI (interessante)

  12. Due pesi, due misure… Amflora potato: starch consists almost solely of amylopectin Ottenuta nel ‘94 tramite antisenso contro un’isoforma di GBSS. Prima applicazione del 1996  15 years to get approval in the EU… http://www.basf.com/group/corporate/en/innovations/research-verbund/research-projects/products/amflora Visser RG, Somhorst I, Kuipers GJ, Ruys NJ, Feenstra WJ, Jacobsen E. (1991) Inhibition of the expression of the gene for granule-bound starch synthase in potato by antisense constructs. Mol Gen Genet. 225:289-96. B. Kull et al.: Genetic engineering of potato starch composition: inhibition of amylose biosynthesis in tubers from transgenic potato lines by expression of antisense sequences of the gene for granule-bound starch synthase. (1995) J. Genet. & Breed. 49: 69-76 Proof of concept: http://www.gmo-compass.org/eng/gmo/db/16.docu.html

  13. Super-patata del Fraunhofer Inst. Muth J, Hartje S, Twyman RM, Hofferbert HR, Tacke E, Prüfer D. (2008) Precision breeding for novel starch variants in potato. Plant Biotechnol J. 6:576-84. http://www.fraunhofer.de/en/press/research-news/2009/12/super-potato.jsp “This fall (2009), 100 tonnes of the new super potato that exclusively produces amylopectin were harvested.” Forse che queste non sono modificazioni genetiche? Same phenotype, essentially same genotype (loss of function)…

  14. Ingegneria metabolica per aumentare l’amido Oltre alla composizione (amylose vs. amylopectin) è possibile modificare ed in particolare aumentare la quantità di amido? Diversi gruppi hanno provato ad alterare gli enzimi della via biosintetica. I risultati? Modesti, nel migliore dei casi, o non riproducibili Un esempio storico consiste nell’uso di una ADP-glucosio PPasi desensitizzata rispetto all’inibitore a feedback 3-PGA (Stark et al., 1992), ma questi risultati non hanno potuto essere riprodotti da un altro gruppo (usando un’altra varietà di patata). Il sistema modello utilizzato è principalmente la patata.Esamineremo in dettaglio alcuni tentativi di modificazione del contenuto di amido.

  15. Schema della sintesi dell’amido Da Kossmann e Lloyd (2000), ridisegnato pol. lineare 1→4 pol. ramificato 1→4, 1 → 6 Suc CYTOSOL Suc Amylopectin Amylose UDP-Glucose + Fructose ADP-Glucose Glucose-1-Phosphate G-1-P G-6-P Glucose-6-Phosphate PLASTID Cellula del tubero G6P è un passaggio obbligato in patata

  16. Import APOPLAST CYTOSOL PLASTID Pi Suc Suc6P SPP Inv starch Susy UDP UDP ADP Gluc Fru SPS Stasy UDP-Gluc PPi ADP-Gluc UGPase PPi HK GK FK AGPase UTP G1P ATP G1P cPGM ADP pPGM PGI G6P ADP F6P G6P Glycolysis

  17. Termodinamica Geigenberger et al. (2004)

  18. 1° approccio: spingere La sintesi di amido è limitata dalla disponibilità di zuccheri o zuccheri fosfati? • Aumentiamo l’idrolisi del saccarosio (invertasi citosolica, saccarosio fosforilasi, …) • Aumentiamo la capacità di fosforilare gli zuccheri (GK) Esempio di manipolazione: patata che esprime l’invertasi e che è stata poi super-trasformata con la gluco-kinasi. Transgeni ingegnerizzati allo stesso scopo (es. Sucrose Phosphorylase) mostrano fenotipi analoghi Trethewey et al. (1998) Combined expression of glucokinase and invertase in potato tubers leads to a dramatic reduction in starch accumulation and a stimulation of glycolysis. Plant J 15: 109-118

  19. The original aim of this work was to increase starch accumulation in potato tubers by enhancing their capacity to metabolise sucrose. Contenuto in carboidrati Invertasi Invertasi + Glucokinasi

  20. Zuccheri fosforilati Un grosso aumento delle concentrazioni, ma una riduzione nel flusso ad amido. L’omeostasi dei metaboliti, specialmente degli zuccheri fosforilati è andata a pallino...

  21. Aumenta la glicolisi e la respirazione Tuber-specific expression of a yeast invertase and a bacterial glucokinase in potato leads to an activation of glycolysis and a reduction of starch Altri tentitivi con lo stesso scopo (aumentare gli zuccheri fosforilati): - Saccarosio fosforilasi - Xilosio isomerasi - ...

  22. Xylose Isomerase Sucrose phosphor. Import APOPLAST CYTOSOL PLASTID Pi Suc Suc6P SPP Inv starch Susy UDP UDP ADP Gluc Fru SPS Stasy UDP-Gluc PPi ADP-Gluc UGPase PPi HK GK FK AGPase UTP G1P ATP G1P cPGM ADP pPGM PGI G6P ADP F6P G6P Glycolysis

  23. Sucrose phosphorylase Suc + Pi  G1P + F I trasformanti possiedono l’attività enzimatica attesa Trethewey et al. (2001) Expression of a bacterial sucrose phosphorylase in potato tubers results in a glucose-independent induction of glycolysis. Plant Cell Environ 24: 357-365.

  24. Cosa provoca la SuPho? Meno peso in patate e minor densità (cioè meno amido per pianta)

  25. Riduzione del contenuto di amido e della resa in tuberi È possibile calcolare la quantità di amido prodotta da ciascuna pianta (come moli di C6/g di tuberi) Anche in questo caso aumenta la glicolisi e la respirazione

  26. La sovraespressione della Saccarosio fosforilasi comporta...

  27. Altri metaboliti

  28. I livelli degli altri enzimi

  29. Aumenta la sintesi del saccarosio …

  30. …ma anche la sua idrolisi.

  31. Che relazione tra futile cycling e ATP demand? Fernie et al. (2002) Tuber-specific expression of a yeast invertase and a bacterial glucokinase in potato leads to an activation of sucrose phosphate synthase and the creation of a sucrose futile cycle

  32. SPS SPP + + Suc6P UDP-Gluc F6P Suc Pi + UDP Sucrose(P) biosynthesis UDP-glucose + D-fructose 6-phosphate   UDP + sucrose 6-phosphate SPS activity is stimulated by an increase in 1) substrates (F6P and UDP-G), 2) allosteric activator (G6P) 3) a decrease in inhibitor (Pi) 4) activation of SnRK1 (stimulated by G6P)… [what about T6P?] In the transgenics all metabolites change in the direction of an activation of SPS.

  33. ATP scende, ADP sale

  34. 2° approccio: tirare TEORIA: sintesi di amido limitata dall’incorporazione di ADP-G (il “rate limiting step”!) da parte della ADP-G PPasi • Aumentiamo la quantità di ADP-G PPasi o diminuiamo la sensibilità all’inibitore a FeedBack Risultati non esaltanti (un piccolo aumento nel flusso ad amido) o non riproducibili (nel caso di ADPG PPasi desensitizzata: A 4–5-fold increase in activity of the enzyme, achieved by transformation with the Escherichia coli ADPglucose pyrophosphorylase gene glgC-16, had no detectable effect on the starch content of developing or mature tubers. No significant effects were found on the contents of ADPglucose, UDPglucose, glucose 1-phosphate, glucose 6-phosphate, PPi, ATP and ADP. Ma allora chi controlla la sintesi di amido???

  35. Una sintesi dell’analisi condotta su una decina di transgeni... Geigenberger P, Stitt M, Fernie AR. (2004) Metabolic control analysis and regulation of the conversion of sucrose to starch in growing potato tubers. Plant, Cell and Environment 27:655–673. Circa 30 papers!!!

  36. Valori del coefficiente di controllo del flusso ad amido Geigenberger et al. (2004)

  37. La sintesi dell’amido ha un RLS! • Si tratta dell’importo di ATP dal citosol al plastidio • La quantità di trasportatore limita il flusso • CJ è intorno a 0.9 • Serie di evidenze per il ruolo del metabolismo degli adenilati nel regolare il flusso ad amido • Ci sono anche altre reazioni con un certo controllo…

  38. Piante alterate nel trasportatore Tjaden et al. (1998)

  39. Morphology and number of wt and transgenic tubers wt as (a) Wild-type, (b) antisense line 676

  40. Notare che i tuberi antisenso mostrano una strana morfologia, con numerosi bitorzoli as sense (c) antisense line 654, and (d) sense line 62

  41. (a) Wild-type, (b) antisense line 676, (c) antisense line 594, and (d) antisense line 654. Note the pronounced elongation and adventitious budding.

  42. sense wt as

  43. CJ ≈ 1 ΔG≈0

  44. Bologa et al (2003) Oxygen gradients within potato tubers expressing Invertase or Sucrose phosphorylase (analysed using a microelectrode) Nothing is for free

  45. Increasing ATP consumption makes the tuber dangerously anoxic Growing tuber Stem WT INV Expression of an ADH1-GUS reporter-gene in wt and transgenic tubers expressing invertase in the cytosol Bologa et al (2003) Plant Physiology 132:2058-2072.

  46. Percentages of label metabolized to starch Wild type Suc Phosphorylase Nei tuberi SuPho la marcatura contribuisce meno all’amido (il resto viene respirato)

  47. Phenotype of fully mature potato tubers constitutively expressing plastidial apyrase. Riewe et al., (2008) Apyrase: enzima che idrolizza ATP Il sensore è plastidiale? (il fenotipo è simile ai tuberi antisenso per il traslocatore e che quindi probabilmente consumano meno ATP e hanno più ossigeno disponibile...)

  48. La sintesi di amido è limitata dal flusso di ATP • Strategia sensata nell’economia cellulare perchè se molto troppo ATP viene impiegato per fare amido, la cellula risponde aumentando la respirazione • Il tubero rischia di andare in ipossia/anossia con tutti i conseguenti pericoli • Altri transgeni che aumentano il flusso ad amido, se esistono, potrebbero essere molto sensibili alle condizioni colturali (es. terreni fradici) Sono stati pubblicati altri transgeni che sembrano aumentare il flusso ad amido...

  49. Production of high-starch, low-glucose potatoes through over-expression of the metabolic regulator SnRK1 Overexpressing SnRK McKibbins et al. Plant Biotechnol J. 2006 4:409-18

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