Kiroptikai spektroszkópia

1. Kiroptikai spektroszkópia Összeállította: Pál Krisztina

2. Bevezető • A kiroptikai spektroszkópiák jelentősége abban áll, hogy segítségükkel különbséget tehetünk enantiomerek között, vagy diasztereomerek közt. • Polarimetria (optikai forgatás adott hullámhosszon), • ORD /optikai rotációs diszperzió/ (optikai forgatás a hullámhossz függvényében) • CD /cikuláris dikroizmus/ (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény abszorpciója közti különbséget méri a hullámhossz függvényében) • Mindegyik technika az (optikailag aktív) anyag és a polarizált fény közti kölcsönhatás mérésén alapszik.

3. Optikailag aktív, királis anyag • Az olyan anyagokat, amelyek a poláros fény rezgési síkját elforgatják, optikailag aktív anyagoknak nevezzük. (A jelenséget kezdetben csak a kristályos anyagok szerkezetének aszimmetriájával hozták összefüggésbe). • Arago, kvarckristály (1811) • Biot, borkősav vizes oldat (1838) • Pasteur, aszimmetria – optikai aktivitás (1848-53) • Kekulé (1856-1863), Le Bel és van't Hoff (1874); aszimmetrikus, tetraéderes C-atom • Királis: tükörképével nem fedésbe hozható. Az egymással fedésbe nem hozható tükörképi szerkezetek olyan viszonyban vannak egymással, mint a jobb és bal kéz (a kéz görög nevéből - kheir - származik az ilyen szerkezetek királis elnevezése). • Optikai aktivitás = forgatóképesség; királis molekulák nem racém halmaza optikailag aktív

4. Királis molekulák egymáshoz való viszonya Enantiomerek (1) • Egy enantiomer az egyike annak a két sztereoizomernek, amelyek egymásnak fedésbe nem hozható tükörképei (mint a jobb és bal kezünk; „ugyanazok”, de mégis ellentétei egymásnak). • Szimmetrikus környezetben: azonos fizikai és kémiai tulajdonságok • Aszimmetrikus környezetben: különböző tulajdonságok.

5. Enantiomerek (2) • Azonos olvadás- és forráspont, törésmutató, oldhatóság, UV-látható, IR- és NMR spektrum. • A különböző viselkedés királis ágenssel való kölcsönhatás esetén érvényesül: • Királis oldószerekben oldhatóságuk különbözik • Királis vegyületekkel különféleképp reagálnak (pl. diasztereomer képzés, rezolválás alapja) • „Királis” fénnyel különféleképp hatnak kölcsön • (Diasztereomerek: részleges tükörképei egymásnak; 1 vagy több aszimmetriacentrum abszolút konfigurációja eltér. Epimerek: csak egy aszimmetriacentrum abszolút konfigurációja más)

6. Kiralitás fajtái Centrális kiralitás Vonal kiralitás Anza kiralitás Helikális kiralitás

7. A fény polarizációja Nem polarizált fény Síkban polarizált fény Az elektromágneses sugárzás (fény) egy haladó hullám, amely oszcilláló elektromos- és mágneses térből áll, melyek kölcsönösen merőlegesek egymásra.Általában az elektromos tér oszcillációja NEM egy fix (y,x) síkon történik. Ilyenkor a sugárzás NEM polarizált. y z x

8. Síkban polarizált fény előállítása A polarizációs szűrő a polarizálatlan fényt síkban (lineárisan) polarizált fénnyé alakítja. Erre jó példa a Polaroid szűrő, mely hosszúkás molekulák párhuzamosan rendezett szálaiból áll. Csak a megfelelő irányban polarizált fénykomponens jut át a szűrőn (az erre merőleges komponens tökéletesen abszorbeálódik).   A vertikálisan polarizált komponens átjut. Polarizálatlan fény A horizontálisan polarizált komponens abszorbeálódik (nem jut át a szűrőn).

9. A lineárisan polarizált fény két cirkuláris komponense

10. Optikai forgatás • A királis minta törésmutatója más a síkban polarizált fény két cirkulárisan polarizált komponensére (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény) nézve. • nbal≠njobb • Ebből következően a két cirkuláris komponens sebességemás és más, amint királis mintán haladnak át. • n=c/v • Eredmény: a síkban polarizált fény polarizációs síkja elfordul ( szöggel).

11. Optikai forgatás (2)

12. Polarimetria: Az optikai forgatás adott hullámhosszon /589nm (Na D-vonal)/

13. Optikai forgatás • Általában specifikus forgatásként van megadva [], melyet adott hőmérsékleten (T) és hullámhosszon (, ált. 589 nm) mérnek (a minta adott koncentrációjú, adott oldószerrel készült oldatát alkalmazva). • Megadása: []D25 = +65° (c=1.0, EtOH) • +, óramutató járásával megegyező irány • – , óramutató járásával ellentétes • Tisztaság meghatározás: • Mért specifikus forgatás*100specifikus forgatás (Pl.: (+6,76°/+13,52°)*100=50%)

14. Optikai rotációs diszperzió (ORD) • Az optikai forgatást mérjük a hullámhossz függvényében. (diszperzió = a hullámhossz függvényében) Detektor: fotoelektron sokszorozó Polikromatikus fényforrás

15. ORD spektrum A csúcs és a vályú közti metszéspont hullámhossza jól egyezik az abszorpciós max –al.. • Egyenletes lefutású görbe (ún. plain curve) - ha a királis molekulában nincsen kromofór (nincs elnyelés). • Kromofórt tartalmazó királis minta esetén ún. Cotton effektus (anomália) rakódik a plain curve-re, ott ahol a minta elnyel.

16. Cirkuláris dikroizmus

17. Cirkuláris dikroizmus (2) • A síkban polarizált fény két cirkuláris komponense (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény) különböző mértékben nyelődik el (abszorbeálódik) királis mintán áthaladva. Összegük: Lineárisan polarizált fény Elliptikusan polarizált fény

18. CD spektrum Abal Ajobb • A CD spektrumban A-t, -t (egyezményesen bal-jobb) tüntetik fel a hullámhossz függvényében. (néha az ellipticitást (), a moláris ellipticitást []) • AbalAjobb A /c·l • (A=Abal-Ajobb) • = bal-jobb A l=190-800nm, e- gerjesztés

19. Enantiomerek CD spektruma • jobb,(R)= bal,(S),  bal,(R)= jobb,(S) •  bal, (R)- jobb,(R) = (R) = jobb, (S)- bal,(S) =  (S) • bal, (S)- jobb,(S)= (S)=  jobb, (R)- bal,(R)= (R) TÜKÖRKÉPI VISZONY

20. CD mérés (spektropolariméter) LS (light source) M (mirror), S (slit), P (prism), SH (shutter) Minta (királis) Detektor: Fotoelektron sokszorozó CDM (CD modulátor, fotoelasztikus modulátor): Felváltva állít elő jobbra és balra cirkulárisan polarizált fényt L (lens), F (filter)

21. UV, ORD, CD összefüggése • Ahol az optikailag aktív anyag elnyel: CD jel jelentkezik, míg az ORD spektrumban Cotton effektus. • Ahol az anyag nem nyel el: nincs CD jel, ORD-ben plain curve.

22. A CD spektroszkópia alkalmazásai • Enantiomertisztaság meghatározás • Abszolút konfiguráció meghatározás • Indukált CD: akirális molekuláknak – királis molekulákhoz kötődve – CD jele indukálódik (komplexképződés tanulmányozása). • Fehérjék tanulmányozása: másodlagos szerkezet, konformációs változások

23. Enantiomertisztaság (ee%) meghatározás • Ee(%): enantiomeric excess, (enantiomer túlsúly v. enantiomer tisztaság). • A racém részen felüli túlsúly.

24. Enantiomertisztaság meghatározás CD (koncentráció független) • Anizotrópia-faktor (g-faktor): • A CD spektrum intenzitása/az abszorpciós spektrum intenzitása. • Enantiomerekre egyenlő nagyságú, ellentétes előjelű.

25. Az enantimerek megkülönböztetése, enantiomertisztaság [Miért fontos?] • Ma a gyógyszerek 40%-a királis hatóanyagú, sokat ebből racémként hoznak forgalomba. • Az enantiomerek farmakokinetikája eltérő, rendszerint különböző receptorokon hatnak. • Csak az egyik fejti ki a kívánt klinikai hatást, a másik vagy egyáltalán nem hat, vagy a nemkívánt hatásokért felelős

26. Contergan-botrány (hatóanyag:thalidomide) Racémként hozták forgalomba • A tájékoztató szerint jól használható köhögés, pánikbetegség, migrén ellen, pszichés traumák esetén nyugtatószerként. Nem terheli a máj anyagcseréjét, és a hányingert is csillapítja. • Célcsoport: állapotos nők. • Feltűnően sok gyermek született elhalt végtagokkal, szellemileg, testileg visszamaradottan.

27. (R)-izomer(S)-izomer teratogén hatású hatékony szedatívum

28. Gyógyszerek enantiomerjeinek hatása • Salbutamol – asztmások gyógyszere: (R): bronchodilatáció, (S): szívdobogásérzés,vérnyomásemelkedés, tremor. • Ibuprofen: (R): hatástalan, (S): lázcsillapító. • Penicillamin:(R): toxikus, (S): krónikus artritis (izületi gyulladás) ellen – fájdalomcsillapító, tünetenyhítő.

29. Az abszolút konfiguráció meghatározás módszerei • (1): CD spektrumok összehasonlítása: Kérdéses vegyülethasonló, ismert térszerkezetűvegyület. • (2):Tapasztalati szabály: Molekulaszerkezet és a CD sáv előjele közt teremt kapcsolatot. (pl. oktáns szabály) • (3): A CD spektrum kvantumkémiai számítása és ennekösszevetése a mért spektrummal.

30. Példa (1) Azonos sávelőjelek, azonos abszolút konfiguráció (-)-2a, (2R, 3S) abszolút konfiguráció Ismeretlen abszolút konfiguráció

31. Oktáns szabály(ketonokra) (2) Amely térrészbe esik az atomok többsége, olyan előjelű lesz a CD sáv. • Adott molekula-geometriához meghatározható a karbonil-csoport 300 nm körül észlelhető n→π* elektronátmenetéhez tartozó CD jel előjele. A molekula 3D modelljét úgy kell elhelyezni a koordináta rendszerben, hogy a karbonil csoport felezőpontja a 3 tengely metszéspontjával egybeessen.

32. Oktáns-szabály alkalmazása (2) (+) Az atomok túlnyomó része (-) térrészbe esik, így ehhez a térszerkezethez negatív karbonil sáv tartozik. (Tengelyre eső atomok hozzájárulása 0). (-) (+) (-) Oktáns projekciós diagram

33. Oktáns-szabály alkalmazása (2) (+) (-) 11b 2 stabil konformációban létezik, az egyikre negatív a másikra gyenge pozitív karbonil jelet jósol. Összegük: gyenge negatív jel (+)

34. Oktáns-szabály alkalmazása (2) Pozitív Cotton effektus = Pozitív CD jel Negatív Cotton effektus = Negatív CD jel ORD spektrum (specifikus forgatás a hullámhossz függvényében)

35. Indukált CD • Királis gazdamolekula vagy kötőhely (ciklodextrin, fehérje/enzim kötőhely, DNS) • Akirális, kromofór vendégmolekula (színezékmolekula, hatóanyagmolekula). • A bekötődő akirális kromofórt a királis környezet vagy szerkezetileg torzítja (királissá teszi) vagy az e-átmeneteit perturbálja  az akirális molekulának a királishoz kötődve CD-jele indukálódik.

36. Indukált CD • A cisz-parinársav (akirális, kromofór), a β-laktoglobulinhoz (királis) kötődik. A látható tartományban (cisz-parinársav elnyelési tartományában) CD jel indukálódik cisz-parinársav (kromofór, akirális vendégmolekula) -laktoglobulin (királis host, látható tartományban nincs elnyelése)

37. Indukált CD 2 db akirális festékmolekula kötődik a fehérjéhez (anomális CD jel: ún. exciton-azt jelzi, hogy 2 festékmolekula kötödik egy fehérjekötőhelyen). Egyre több festékmolekulát hozzáadagolva, egyre nagyobb az indukált CD jel (egyre több festékmolekula kötődik a fehérjén). A CD jel az akirális festékmolekula elnyelési tartományában jelentkezik.

38. Fehérjék CD spektroszkópiai vizsgálata • Környezeti változások (pH, hőmérséklet stb.) → konformációs változás • CD spektrum alakja érzékenyen tükrözi a fehérje konformáció változásait. • A CD spektroszkópia jól használható (denaturációs vizsgálatok, fehérjekötődési vizsgálatok).

39. Másodlagos szerkezet • Fehérjék esetében a távoli UV tartományban (180nm - 260nm) - az amid kromofóroktól kapunk jelet. • 190-240 nm közt a CD spektrum az amid csoportok egymáshoz képesti orientációjára jellemző → Ha más a másodlagos szerkezet, más a CD spektrum.

40. Tiszta másodlagos szerkezetek CD spektruma • Ebben a tartományban (190-240nm) adott fehérje CD spektruma a „tiszta” másodlagos szerkezetek CD spektrumának lineárkombinációjaként írható. -hélix -turn rendezetlen szerkezet -redő

41. -hélix -redő rendezetlen szerkezet Lineárkombináció Ismeretlen fehérje CD spektruma = referencia CD spektrumok lineáris kombinációja

42. Illesztés Referencia spektrumként: tiszta másodlagos szerkezetek CD spektruma (szintetikus polipeptidek). Vagy valós fehérjék. (Programok legalább 2, de max. 8 féle komponenst használnak).

43. Eredmény A mért CD spektrum alapján megkapjuk a vizsgált proteint alkotó másodlagos szerkezetek százalékos arányát. Másodlagos szerkezetek

44. -redő rendezetlen szerkezet • Mivel a három alap konformáció (-hélix, -redő,rendezetlen szerkezet) CD spektruma igen különbözik egymástól, kis, lokális konformációs változások is szembetűnő változásokat okoznak a CD spektrumban. -hélix -hélix -redő rendezetlen szerkezet

45. A ribonukleáz hődenaturációja -hélix rendezetlen szerkezet • Jobbra: 0.02% Ribonukleáz A,(0.001M HCl) CD spektruma 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 70, 80 °C-on. • Balra: A CD-jel a hőmérséklet függvényében (222nm-en).

46. Köszönöm a figyelmet!