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研究生实验技能培训讲座 －－细胞培养基本知识

研究生实验技能培训讲座 －－细胞培养基本知识. 实验教学中心 侯孟君. 基本概念. 细胞培养技术 细胞系 细胞株 原代培养 传代. 细胞培养 (cell culture) 技术 即是选用各种细胞的 最佳生存条件 对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于医学研究领域的重要技术。. 细胞系. 培养物开始 第一次 传代培养后的细胞 有限细胞系（ Finite Cell Line ） 连续细胞系或无限细胞系（ Infinite Cell Line ） 肿瘤细胞系或株 我国已建细胞系主要为这类细胞。 肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞

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研究生实验技能培训讲座 －－细胞培养基本知识

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Presentation Transcript

  1. 研究生实验技能培训讲座 －－细胞培养基本知识 实验教学中心 侯孟君

  2. 基本概念 • 细胞培养技术 • 细胞系 • 细胞株 • 原代培养 • 传代

  3. 细胞培养(cell culture)技术 即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于医学研究领域的重要技术。

  4. 细胞系 • 培养物开始第一次传代培养后的细胞 • 有限细胞系（Finite Cell Line） • 连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line） • 肿瘤细胞系或株我国已建细胞系主要为这类细胞。 肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞 具有不死性和异体接种致瘤性。

  5. 细胞株 • 用单细胞分离培养增殖形成的具特定生长特性的细胞群 • 再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。

  6. 细胞系或细胞株的命名 以供体患者的姓名命名：HeLa （来源于宫颈癌）以时间地点来命名： CHO 中国仓鼠卵巢细胞 （Chinese Hamster Ovary， ） 宫-743： 宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立 NIH3T3：美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立 每3天传代，每次接种3×105细胞／ml 以组织来源命名：如BHK(幼地鼠肾细胞) 以临床疾病类型命名： 如BALL-1细胞系(来自B淋巴细胞急性白血病人白细胞)

  7. 原代培养 • 直接从体内取出的细胞进行的第一次培养物。 • 优点： 组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。 大鼠肝细胞原代培养 1.细胞种类：大鼠原代肝细胞；2.培养的天数：刚分离，未经培养； 细胞状态与特征简述：刚分离时球形透亮，贴壁 后呈不规则。

  8. 传代 • 将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养 • 原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。 HepG2细胞 细胞种类：人肝肿瘤细胞； 培养的天数：传代培养2天； 细胞状态与特征简述：呈多角型、不规则 贴壁生长，成团聚集。

  9. 传代注意事项 • 接种数量为5×104～8×105个/ml 传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。 • 培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。 • 如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。

  10. 细胞培养的基本条件 • 无菌条件 • 细胞生长条件 • 细胞检测条件 • 细胞保存条件 • 实验室安全

  11. 细胞培养的无菌环境 • 无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。 • （使用前）紫外照射（1小时） • 每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒

  12. 生物安全柜 • 使用前开启柜内紫外灯照射10－30分钟， • 预工作10－15分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态。 • 使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。 • 还要定期用福尔马林熏蒸。

  13. 常用培养器皿及清洗消毒 • 玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤 • 新的橡胶制品洗涤方法 0.5M NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5MHCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用。

  14. 消毒前包装 • 常用的包装材料 牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、铝箔

  15. 火焰消毒 • 在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 • 培养瓶 • 滴管、试管、吸管

  16. 细胞培养的实验用品 • 细胞培养瓶 • 25平方厘米，正方斜颈 • 25平方厘米，三角斜颈 • 75平方厘米，正方斜颈 • 75平方厘米，三角斜颈 • 150平方厘米，正方斜颈

  17. 细胞培养板 • 6孔， • 12孔， • 24孔， • 48孔 • 96孔

  18. 细胞培养皿 • 35mm •  60mm  • 100mm 

  19. 冻存管 • 1.2ml • 2ml， • 5ml

  20. 离心管 • 15ml •  50ml • 细胞刮

  21. 滤 器 大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。

  22. 液氮罐

  23. 何处购买细胞 • ATCC 细胞库(www.atcc.org). • 美国菌种保藏中心又称美国模式菌种收集中心(ATCC)是位于马里兰洲洛克菲勒的一家私营的，非赢利性组织。 • 目前它可以提供以下物品 细胞系3000种 细菌和噬菌体 15000种 动植物病毒 2500种 原生动物 1200种以及重组物品 • 欧洲动物细胞库(ECACC)和日本细胞库(RCB)

  24. 国内细胞库 中国科学院细胞库 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心联系方法：地址：上海市岳阳路320号，200031电话：021-54920404， 54920405Fax: 021-54920406联系人：陈松华，徐惠均e-mail: shchen@sibs.ac.cn

  25. http://sub.whu.edu.cn/cctcc/fzlbc/pywml.htm • 中国典型培养物保藏中心 也称武汉大学保藏中心，是国家知识产权局指定的专利培养物/生物材料／菌种保藏机构

  26. 订购程序 • 向中心订购培养物，可查阅CCTCC培养物目录，并向CCTCC提出订购培养物的名称、CCTCC保藏号等内容。 • 联系方式可通过电话、传真，信函，电子邮件等方式。 电话：027-87682319 传真：027-87883833 E-mail:cctcc@whu.edu.cn • 细胞系：300～500元/每株 • 菌种准备时间 一般情况CCTCC收到订购人的汇款后的3-4天寄出，每周寄送二次（周一，周五）。

  27. 细胞的营养 • 碳水化合物、氨基酸和脂类三大类 • 也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素

  28. 细胞培养液 • 水 • 平衡盐溶液 • pH调节液 • 消化液 • 抗生素溶液 • 培养基

  29. 细胞培养用液的配制 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 桶装水：怡宝

  30. 平衡盐溶液 • 主要由无机盐和葡萄糖配制而成 • 作用 维持渗透压、缓冲和调节酸碱度 • 常用的缓冲液 生理盐水 PBS Hanks液 （D-Hank‘s常用于配制胰酶溶液）

  31. pH调节液 (1) 碳酸氢钠液 (2) Hepes缓冲液 是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂 通常使用浓度为10～15mM

  32. 消化液 • 胰蛋白酶溶液 • 主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来 • 常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。 • (2) EDTA溶液 • 作用机制是破坏细胞间的连接。 • 对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液 • EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶 • (3)胶原酶溶液 • 胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。

  33. 抗生素溶液 • 通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。 • 青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。 • 培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 • 庆大霉素：每毫升100单位

  34. 培养基 • 分天然培养基和合成培养基 • 天然培养基： 血清 血浆 组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）

  35. 合成培养基 • 根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。 • 包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物 • 目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、TC199、MEM、 • 另有无血清培养基、无蛋白培养基

  36. RPMI1640 • 最初是由G，E，Moore为培养小鼠白血病细胞而设计的。 • 开始的配方特别适合于悬浮细胞生长，主要是针对淋巴细胞，后经过改良，从RPMI1630、RPMI1634、直至RPMI1640。 • 其组分较为简单，适合许多种细胞生长，如肿瘤细胞、正常细胞、原代培养、传代培养等。 • 尤其适合人白细胞，如H9、T-15、HL-60、IM-9、Jurkat、 K-562 及KATO—III等细胞系的培养。

  37. RPMI1640种类 • RPMI—1640（A） （不含谷氨酰胺、可高压灭菌） • RPMI—1640（A）无酚红 （不含谷氨酰胺、高压灭菌） • RPMI—1640 （含谷氨酰胺、除菌过滤灭菌）

  38. DMEM细胞培养基 • 是在MEM培养基的基础上研制的 • 与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。 • 高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。 • DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】 DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌过滤灭菌】 DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌过滤灭菌】。

  39. 干粉培养基的配制 • 认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。 • 配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。 • 配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。 • 所用器皿应严格消毒。 • 配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。

  40. 血清的使用 • 血清质量好坏是实验成败的关键 • 常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，胎牛血清是品质最高的。 • 优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 • 血清的灭活（消除补体活性） 56℃ ，30 分钟。 • 血清的消毒 过滤除菌。

  41. 牛血清 • 胎牛血清应取自剖腹产的胎牛 • 新牛血清取自出生24小时之内的新生牛 • 小牛血清取自出生10－30天的小牛 • 使用浓度： 一般为5－20％，最常用是10％

  42. 何谓FBS、FCS、 CS、HS ? • FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。 • CS (calf serum) 则是指小牛血清 • HS (horse serum) 则是指马血清

  43. 血清解冻步骤 • 逐步解冻法 – 20℃或–70 ℃至4 ℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml。 • 勿直接由–20 ℃至37 ℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

  44. 无机盐 • CaCl2、KCl 、MgSO4、NaCl 、NaHCO3、NaH2PO4 • 对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。

  45. 氨基酸 • 缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型) • 细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由其他氨基酸或糖类转化合成 • 谷氨酰胺具有特殊的作用，补加一定量的谷氨酰胺 。 • L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性 。

  46. 休息一会儿吧！ • 伸伸退，弯弯腰！

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