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LC/MS を用いた生物試料中の ジラム、マンゼブの定量. 株式会社住化分析センター ○木村 義孝、村上 雅志、竹田 菊男. ジラム. 構造 物性. マンゼブ. 構造 物性. 分析上のポイント. ジチオカルバメート系農薬は、金属錯体のままではほとんどの溶媒に溶けない 対象物質をアルカリ性 EDTA 溶液でナトリウム塩に変換して可溶化 ヨウ化メチルでメチルエステル化 ジラムはジメチルジチオカルバミン酸メチル (DMDTC-Me) として分析 マンゼブはエチレンジチオカルバミン酸ジメチル (EBDTC-2Me) として分析. 分析上の注意点.
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LC/MSを用いた生物試料中のジラム、マンゼブの定量LC/MSを用いた生物試料中のジラム、マンゼブの定量 株式会社住化分析センター ○木村 義孝、村上 雅志、竹田 菊男
ジラム • 構造 • 物性
マンゼブ • 構造 • 物性
分析上のポイント • ジチオカルバメート系農薬は、金属錯体のままではほとんどの溶媒に溶けない • 対象物質をアルカリ性EDTA溶液でナトリウム塩に変換して可溶化 • ヨウ化メチルでメチルエステル化 • ジラムはジメチルジチオカルバミン酸メチル(DMDTC-Me)として分析 • マンゼブはエチレンジチオカルバミン酸ジメチル(EBDTC-2Me)として分析
分析上の注意点 • ジメチルジチオカルバミン酸及びエチレンジチオカルバミン酸を構造に持つ物質の分別定量ができない ジラム換算合量及びマンゼブ換算合量 • DMDTC-Me (ジラムの誘導体化物)を生成する物質: チウラム、有機ニッケル等 • EBDTC-2Me (マンゼブの誘導体化物)を生成する物質: ジネブ、マンネブ、アンバム、ポリカーバメート等
ジラム、マンゼブ(生物) ×2 • 分析フローチャート 生物試料 10 g ホモジナイズ 振とう 遠心分離 ジクロロメタン 10 mL + 5% L-システイン-5% EDTA溶液 25 mL ホモジナイズ5分 30分 3000rpm 5分 pH調整 メチル化・抽出×2 濃縮・転溶 0.4 mol/L TBA溶液 5 mL 2 mol/L塩酸、pH7.5~7.7 0.1 mol/Lヨウ化メチル含有 アセトン/ヘキサン(1:2) 50 mL 約2 mLまで濃縮 アセトニトリル転溶、 約2 mLまで濃縮 クリーンアップ 濃縮 LC/MS-SIM Sep-Pak Plus C18 + Sep-Pak Plus Alumina N 負荷、アセトニトリル 1 mLで洗浄負荷 アセトニトリル 7 mL + 25 mLで溶出 約0.5 mLまで 精製水で1.0 mLに 定容 ジラム:Pos+ マンゼブ:Neg-
6000 4000 2000 0 8 10 12 14 16 18 min 6000 4000 2000 0 8 10 12 14 16 18 min 6000 4000 2000 0 8 10 12 14 16 18 min 6000 4000 2000 0 8 10 12 14 16 18 min 標準物質測定クロマトグラム ジラム(定量イオン): 2 ng ジラム(確認イオン) マンゼブ(定量イオン): 0.2 ng マンゼブ(確認イオン) 標準物質測定クロマトグラム
LC/MS測定条件の検討 • 測定モードと感度 (単位:pg、約S/N=3) • APCIモードでは、ベースラインの異常上昇及び感度変動などが顕著 → ESIモードでの測定 • ESI-Positive モードでは、マンゼブ定量イオン(m/z 241)のベースラインが上昇 → ジラムはESI-Positiveモード、 マンゼブはESI-Negativeモードで測定
ホモジナイズ後抽出方法の検討 • 既報における問題点 • クロロホルム/ヘキサン(3:1)によるメチル化・抽出 → LC/MSでの測定においてイオン源に白い粉末や油状の物質が付着 → ベースラインの著しい変動や感度の低下 → 生物試料を使用しない前処理操作でも低い回収率 • 抽出溶剤変更の検討 ジクロロメタン/ヘキサン(3:1)、ヘキサン 及び アセトン/ヘキサン(1:2) 採用 • 市販のDMDTC-Me及びEBDTC-2Me (林純薬工業株式会社)の測定結果 → DMDTC-Me:66.8%、EBDTC-2Me:69.4%
濃縮方法の検討 • エバポレーター濃縮による回収率の低下 • ジラム: 揮散 • マンゼブ: 分解 • 防止策 • 酸化防止剤:1% L-システイン含有メタノール添加 • 濃縮は約2 mLまでとし、乾固を避ける 回収率の改善
検量線の作製方法 • 本法の誘導体化効率(回収率) • ジラム: 66.8% • マンゼブ: 69.4% • 検量線用の標準溶液 • 試料と同様の操作を行い調整
EBDTC-2Me, MSD2 239 Area = 60573.097*Amt +0 Area 120000 7 100000 DMDTC-Me, MSD1 136 80000 Area = 12680.7058*Amt +0 Area 6 60000 250000 40000 7 5 20000 4 200000 3 2 1 0 Correlation: 0.99955 0 1 Amount[ng] 150000 6 100000 5 50000 4 3 2 1 0 Correlation: 0.99996 0 10 Amount[ng] 検量線 ジラム(0.2~20 ng) マンゼブ(0.02~2 ng)
IDL、MDL • MDL • IDL
操作ブランク、添加回収試験 • 操作ブランク • 検出せず • 添加回収試験(カレイ)
環境試料分析例 1500 1000 500 8 10 12 14 16 18 min 1500 1000 500 8 10 12 14 16 18 min 1500 1000 500 8 10 12 14 16 18 min 1500 1000 500 8 10 12 14 16 18 min ジラム(定量イオン):不検出 ジラム(確認イオン) マンゼブ(定量イオン):不検出 マンゼブ(確認イオン) カレイ測定クロマトグラム
MSD1 136, EIC=135.7:136.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: 90 1000 750 500 250 8 10 12 14 16 18 min MSD1 138, EIC=137.7:138.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: 90 1000 750 500 250 8 10 12 14 16 18 min MSD2 239, EIC=238.7:239.7 API-ES, Neg, SIM, Frag: Var 1000 750 500 250 8 10 12 14 16 18 min MSD2 191, EIC=190.7:191.7 API-ES, Neg, SIM, Frag: Var 1000 750 500 250 8 10 12 14 16 18 min 環境試料分析例 ジラム(定量イオン):試料濃度 15 µg/kg ジラム(確認イオン) マンゼブ(定量イオン):試料濃度 1.5 µg/kg マンゼブ(確認イオン) 添加回収試験クロマトグラム(カレイ)
まとめ • 本法により、生物試料中ジラム1 μg/kgレベルおよびマンゼブ0.1 μg/kgレベルの定量が可能である。 • なお本検討の内容は、環境省より委託された「平成17年度化学物質環境実態調査暴露量調査(生物)分析調査」によるものである。