TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR

1. TÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNÓSTICO GENÉTICO I. Mapas de restricción. Marcadores moleculares: RFLP, SSLP, VNTR (minisatélites y microsatélites), SNP. Secuenciación. Hibridación. Obtención de sondas. Transferencia Northern y Southern. ADNc. PCR. Microarray.

2. TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR • FRAGMENTACIÓN DEL ADN • CLONACIÓN • AMPLIFICACIÓN DEL ADN • SECUENCIACIÓN DEL ADN • HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

3. FRAGMENTACIÓN DEL ADN

5. CLONACIÓN EN PROCARIOTAS • Aislar y multiplicar en tubo de ensayo un determinado gen o, en general, un trozo de ADN

7. CLONACIÓN DEL ADN

8. ADN donante Vector recombinante con el inserto 1 o 2

9. IDENTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS RECOMBINANTES RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS: El plásmido que contiene el gen de la proteína de interés también contiene un gen de resistencia a un antibiótico BACTERIAS “COLOREADAS”: El gen de nuestra proteína se inserta en el plásmido interrumpiendo al gen de una enzima que produce color azul

10. ELECTROFORESIS

11. ELECTROFORESIS

12. ELECTROFORESIS

13. TIPOS DE GELES • POLIACRILAMINA: para fragmentos de ADN menores de 500 nucleótidos • AGAROSA: para fragmentos de ADN mayores de 500 nucleótidos • CAMPO PULSANTE (agarosa): fragmentos grandes de ADN, incluso cromosomas completos

14. MAPAS DE RESTRICCIÓN

15. MAPAS DE RESTRICCIÓN

16. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

17. SECUENCIACIÓN DE UN FRAGMENTO PURIFICADO DE ADN * Método Enzimático de Sanger * Método Químico de Maxam y Gilbert

18. MÉTODO ENZIMÁTICO DE SANGER

19. MÉTODO ENZIMÁTICO DE SANGER • Síntesis in vitro de ADN en presencia de nucleótidos trifosfato terminadores de cadena A C G T A C G T Autorradiografía (300 nt) Secuenciador Automático (+700 nt)

20. CROMATOGRAMA DE SECUENCIA

21. MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT

22. HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS La hibridación se produce sólomente entre cadenas complementarias

23. HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS SONDA: secuencia conocida de ADN o de ARN que es complementaria a la secuencia de interés y que se apareará con ella; se utiliza para localizar secuencias específicas de ADN

24. SONDAS • Marcaje de fragmentos de ADN: • sondas altamente marcadas • sondas marcadas en 5´ • Tipo de marcaje: • radiactivo: p32 • químico: fosfatasa alcalina, biotina, etc.

25. SONDAS Altamente Marcadas Marcadas en 5´ Marcaje de fragmento de DNA (Obtención de sondas): Sondas altamente marcadas o marcadas en 5´. Marcaje radiactivo o químico.

26. ADNc

27. En un corte histológico para detectar la expresión de un gen concreto. Localiza los ARNm en las posiciones precisas que ocupan en las células o tejidos Hibridación “in situ”

28. Hibridación “in situ” con fluorescencia FISH

29. SOUTHERN BLOT

30. Microarrays

31. MARCADOR MOLECULAR Sitio de heterocigosidad de ADN, no asociado necesariamente a una variación fenotípica, que se utiliza como una etiqueta de un locus cromosómico particular • SNP (polimorfismo de un solo nucleótido): sustitución de un nucleótido por otro • SSLP (polimorfismos en la longitud de secuencias simples): variación en el tamaño del fragmento por inserción/deleción • VNRT (número variable de repeticiones en tándem): • Minisatétiles (centrómeros y telómeros) • Microsatétiles (distribuidos por todo el genoma)

32. RFLP (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción): Método para la detección de los distintos polimorfismos, mediante la utilización de enzimas de restricción LOS POLIMORFISMOS SE COMPORTAN COMO ALELOS (dos alelos por individuo)

33. ER ER ER DETECCIÓN DE SNPs MEDIANTE RFLP 1, 1 1, 2 2, 2 1 ER ER 2 SNP

34. ER ER ER ER ER ER ER DETECCIÓN DE SNPs MEDIANTE RFLP 1, 1 1, 2 2, 2 1 ER 2 SNP

35. PADRE MADRE HIJO Padre Madre Hijo

36. 1 2 1 DETECCIÓN DE VNTR MEDIANTE RFLP ER ER ER ER ER ER 2 ER ER

37. VNTR-microsatélites (2-5 pb)