Enzymologie

1. Enzymologie Ivo Šafařík, Mirka Šafaříková biomagnetický výzkum a technologie ivosaf@yahoo.com ivosaf@seznam.cz

2. Kde najdu informace? http://www.usbe.cas.cz/people/safarik/ • Stránky v češtině • Přednášky na Jihočeské universitě v Českých Budějovicích • Enzymologie - Přednášky v PowerPointu, verze 2002 a 1995

3. Enzymologie Nauka o biokatalýze a biokatalyzátorech

4. Enzymologie • studium struktury enzymů • studium kinetiky enzymových reakcí • studium reakčních mechanismů • studium forem a lokalizace enzymů • studium vztahu enzymů k patologii organismů • praktické využití enzymů • příprava a studium umělých enzymů

5. Co nás čeká ??? 1. Struktura bílkovin 2. Klasifikace a názvosloví enzymů, charakterizace jednotl. tříd enzymů 3. Koenzymy, jejich klasifikace, charakterizace, modifikace, využití 4. Struktura a funkce enzymů, mechanismy enzymových reakcí 5. Kinetika enzymových reakcí. Kinetika inhibice enzymových reakcí 6. Charakterizaci enzymů (MW, IEP, KM, pH a teplotní optimum.... 7. Metody pro stanovení enzymových aktivit 8. Inhibitory a aktivátory. Klasifikace, charakterizace, využití 9. Upstream processing 10. Downstream processing 11. Imobilizace a stabilizace enzymů 12. Aplikace enzymů 13. Nejnovější poznatky v enzymologii

6. Katalýza • Katalýza - Berzelius 1838 Katalyzátor • látky urychlující chemické reakce • nemění rovnováhu chemických reakcí • snižují aktivační energii

7. Biokatalyzátory • globulární bílkoviny • RNA - CZECH a ALTMAN (1986) • jednoduchá x složená bílkovina • více než 3000 enzymů v buňce • enzymy jsou druhově specifické • velmi účinné (až 5.104 molekul/s) • specifita reakční, substrátová • aktivní za mírných podmínek • možnost regulace • netoxické

8. Historie poznání enzymů • 18 století: trávicí účinek žaludeční šťávy • 1878: KŰHNE zavedl název ENZYM (En Zyme - v kvasnicích) • 1897 - BUCHNER - extrakt kvasinek katalyzuje kvašení • 1926 - SUMNER - bílkovinná povaha enzymů - ureasa

9. Enzymové technologie • Použití isolovaných enzymů, enzymových komplexů a buněk • Isolace enzymů • Imobilizace enzymů, enzymových komplexů a buněk • Enzymové procesy v nevodných systémech, micelách, dvoufázových systémech

10. Technické enzymy • Proteasy (bakteriální) • Syřidla • Glukoamylasy • Alfa-amylasy • Glukosaisomerasy

11. Enzymy jsou proteiny • Proteiny jsou složeny z 20 kódovaných aminokyselin • L-enantiomery

12. R představuje jeden z 20 různých typů postranních řetězců Hlavní řetězec je neměnný - základ peptidové vazby, existence dvou enantiomerních konfigurací, tvorba vodíkových můstků Chemická struktura aminokyselin

13. Hlavní řetězec aminokyselin – vliv pH • přifysiologickém pH mají volné aminokyseliny charakter amfiontu(“zwitterion”) • pK COOH skupiny je mezi 1.7-2.6 • pK NH2skupiny je mezi 9.0-10.8 • pI = 0.5 (pK1 + pK2) pH 1 pH 7 pH 11

14. aminokyseliny - optická aktivita • alfa atom uhlíku je asymetrickýpro 19 z 20 běžných aminokyselin (výjimkou je glycin,kde R = H). 19 aminokyselin se vyskytuje jako L-isomer. D-aminokyseliny jsou vzácné. L-isomer rovina souměrnosti D-isomer (vzácný) Threonin a isoleucin obsahují dva asymetické atomy uhlíku existují čtyři stereoisomerní formy

15. Klasifikace aminokyselin podle postranních řetězců • hydrofobní • hydrofilní • - neutrální • - kyselé • - zásadité

16. Přehled aminokyselin • 6 hydrofilních neutrálních postranních řetězců.Všechnyobsahují =O, O-H nebo N-H skupiny které tvoří vodíkové můstky. • 2 hydrofilní kyselé postranní řetězce.Obsahují karboxylové skupiny COO-s negativním nábojem při fysiologickém pH. pK 3.9 (aspartát) and 4.3 (glutamát). • 3 hydrofilní basické postranní řetězce.Obsahují N-H skupiny (protonované u lysinu a argininu přifysiologickém pH). • 9 hydrofobních postranních řetězců.Všechny obsahují zejména C-H vazby které málo interagují s molekulami vody. Jsou většinou uvnitř molekuly proteinu.

17. Tvoří vodíkové můstky. Obvykle na povrchu proteinů. Šest hydrofilních neutrálních aminokyselin Serine Threonine Tyrosine Asparagine Glutamine Cysteine Ser, S Thr, T Tyr, Y Asn, N Gln, Q Cys, C

18. Tvoří vodíkové můstky. Obsahují ionizovatelné skupiny. Tři basické aminokyseliny Dvěkyselé aminokyseliny Aspartate Glutamate Asp, D Glu, E Lysine Arginine Histidine Lys, K Arg, R His, H

19. Histidin • pK cca 6 při fysiologickém pH imidazolový kruh může fungovat jako donor i akceptor protonů • Imidazolový kruh zároveň působí jako nukleofil • Histidin se vyskytuje v aktivním místě velké řady enzymů

20. Devět hydrofobních aminokyselin Ponořeny v proteinech Netvoří vodíkové můstky Glycine, Gly, G Alanine, Ala, A Valine, Val, V Leucine, Leu, L Isoleucine, Ile, I Netvoří vodíkové můstky Methionine, Met, M Phenylalanine, Phe, F Tryptophan, Trp, W Proline, Pro, P (imino kyselina)

21. Tvorba peptidové vazby Peptidová vazba spojuje aminokyseliny vede ke vzniku proteinů Polypeptidický řetězec vždy začíná na N-konci (aminokyselinový zbytek č. 1; volná NH3+skupina je nalevo) a končí na C-konci (volná COO-skupina napravo).

22. Peptidická vazba je rigidní • Mezi sousedními postranními řetězci jsou třivazby. • Jedna z vazeb vykazuje částečně násobný charakter a nemůže rotovat - je rigidní. • Ostatní dvě vazby mohou rotovat. • Tyto skutečnosti umožňují vznik sekundárních struktur(a-helix,b-struktury).

23. Čtyřiúrovně strukturybílkovin Primární struktura (chemická):pořadí aminokyselin v řetězci, další detaily (umístění disulfidických můstků, prosthetickýchskupin, glykosylace). Sekundární struktura:vzájemný prostorový vztah sousedních nebo blízkých aminokyselin. Typické struktury: a-helix, b-struktura. Stabilizace pouze vodíkovými můstky. Terciární struktura:vzájemný prostorový vztah vzdálených částí řetězce. Stabilisace vodíkovými můstky, iontovými interakcemi, hydrofobními interakcemi a disulfidickýmimůstky. Kvartérní struktura:prostorové uspořádání molekulových podjednotek, které tvoří celistvé molekuly (např: 2a a 2břetězce hemoglobinu)

24. Bílkoviny:a- helix Vlastnosti: (1) „Tyčkovitý“ tvar, postranní řetězce směřují ven (2) Všechny C=O a N-H skupinyz peptidických vazeb vytváří vodíkové můstky (3) Vodíkové můstky jsou rovnoběžné s osou helixu (4) 3.6 aminokyselinového zbytku na jednu otočku (5) Pravotočivý směr díky přítomnosti L-aminokyselin

25. Bílkoviny: α-helix

26. Bílkoviny: β-struktury Maximálně „natažený“ proteinový řetězec. • Vlastnosti: • (1) Řetězec je natažen, postranní řetězce směřují střídavě nahoru a dolů • (2) Všechny C=O & N-H skupiny z peptidických vazeb vytváří vodíkové můstky • (3) Vodíkové můstky se vytváří mezi jednotlivými řetězci a jsou kolmé na řetězce • (4) Paralelní struktury: N-konce jsou na téže straně • (5) Antiparalelní struktury: N-konce jsou na opačných stranách

27. Bílkoviny: β-struktury

28. Bílkoviny: β-struktury

29. Supersekundární struktura

30. Intramolekulární vazby

31. Terciární struktura - myoglobin

32. Kvartérní strukturaglutaminsynthetasa12 podjednotek

33. Aminokyselinové složení proteinů • Úplná hydrolýza proteinu (6 M HCl, 110 °C, 20 – 72 hod.) • Dělení aminokyselin ionexovou chromatografií • HPLC na reverzních fázích • Fotometrická detekce po reakci AK s ninhydrinem • Automatické analyzátory aminokyselin

34. Počet polypeptidických řetězců • Stanovení počtu N- a C- koncových aminokyselin • Značení α-amino skupiny (např. 2,4-dinitrofluorbenzenem)  hydrolýza proteinu  detekce značených aminokyselin • Odštěpení aminokyselin z C-konce karboxypeptidasou • Podmínka: řetězce mají různé koncové aminokyseliny!

35. Určení N-koncové aminokyseliny

36. Přerušení disulfidických můstků • Tvořeny cysteinem • Uvolnění jednotlivých řetězců • Oxidace kyselinou permravenčí na kys. cysteovou

37. Přerušení disulfidických můstků • Redukce merkaptoethanolem a následující karboxymethylace kyselinou jodoctovou karboxymethylcystein

38. Stanovení primární struktury • Postupné odbourávání od N-konce • Edmanův postup • Použití fenylisothiokyanátu • Možno analysovat peptidy do 60 - 70 aminokyselin

39. Edmanovo odbourávání

40. Štěpení dlouhých řetězců • Specifické proteasy (trypsin, chymotrypsin, pepsin, thermolysin...) • Chemické štěpení (bromkyan štěpí za methioninem) • Následná separace štěpů chromatografickými a elektroforetickými metodami • Nutná dvě nezávislá štěpení (metoda překrývajících se štěpů)

41. Kdo byl první??? • Ribonukleasa (1960) • F. Sanger – Nobelova cena